Chƣơng 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. VECTOR BIỂU HIỆN
1.3.1. Khái niệm
Vector biểu hiện gen là những vector tách dòng mang các promoter mạnh, cho phép biểu hiện đồng thời cả gen chỉ thị và gen tách dòng tạo lên các protein lai.
Một vector biểu hiện gen gồm các thành phần chủ yếu: promoter mạnh, trình tự sao chép, vị trí khởi đầu phiên mã, vị trí bám của riboxom, tín hiệu kết thúc dịch mã, các trình tự cắt nối và các gen chỉ thị.
1.3.2. Các hệ thống biểu hiện gen
Biểu hiện gen tái tổ hợp là kỹ thuật quan trọng quyết định tính thành bại của kỹ tuật gen. Hệ thống tế bào chủ thường được dùng để biểu hiện gen bao gồm: Tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men, tế bào trứng của động vật có vú và Baculovirut.
1.3.2.1. Biểu hiện gen trong tế bào vi khuẩn
Vi khuẩn E. coli là tế bào chủ được ưa chuộng nhất trong biểu hiện gen, do mang nhiều ưu điểm hơn so với các tế bào khác:
Vi khuẩn E. coli có tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp mạnh, chỉ sau khoảng 8 giờ nuôi cấy ở điều kiện thích hợp đã có sản phẩm protein tái tổ hợp, khả năng tạo ra sản phẩm gen cao từ 50mg/lít đến 500mg/lít.
Biểu hiện gen trong tế bào E. coli có thể giảm được các chi phí cho công nghệ và hóa chất nên giá thành sản phẩm hạ.
Cấu trúc bộ gen E. coli và các đặc điểm di truyền đã được biết tương đối đầy đủ, tạo nên điều kiện thuận lợi khi biểu hiện protein tái tổ hợp ở E. coli.
Có rất nhiều chủng vi khuẩn E. coli được sử dụng trong biểu hiện gen trong đó chủng E. coli BL21 là một trong những chủng E. coli được ưa chuộng và sử dụng rộng rãi để biểu hiện các loại gen khác nhau.
Tuy nhiên nó cũng có những hạn chế sau:
Các gen mã hóa các loại protein có kích thước lớn hơn 50kD, protein giàu cystein (ví dụ như gen mã hóa plasminogen) hoặc những sản phẩm protein có sự hình thành liên kết disunfua (S - S) rất khó biểu hiện gen trên vi khuẩn E. coli.
Tế bào E. coli có thể cho biểu hiện tốt các loại protein không biến đổi cấu trúc phân tử sau khi dịch mã và không có quá trình glycosyl hóa.
Một số chủng vi khuẩn E. coli có thể gây bệnh hoặc có thể tạo độc tố khi biểu hiện gen của sinh vật bậc cao.
1.3.2.2.Biểu hiện gen trong tế bào Baculovirus
Baculovirus cho phép biểu hiện các protein có phản ứng glycosyl hóa chính xác và có phản ứng cắt chuỗi peptid tín hiệu.
Sử dụng Baculovirus trong biểu hiện gen có hiệu quả cao, giá thành sản phẩm protein tái tổ hợp giảm.
Hạn chế lớn nhất khi biểu hiện gen ở Baculovirus là sự tạo thành protein tái tổ hợp chậm, thường sau 4 -5 ngày nuôi cấy mới có sản phẩm, thời gian nuôi cấy lâu từ 14 – 15 ngày, mặt khác điều kiện công nghệ và môi trường nuôi cấy phức tạp.
1.3.2.3.Biểu hiện gen trong tế bào nấm men.
Nấm men là nhóm tế bào chủ được sử dụng rộng rãi trong biểu hiện gen của sinh vật bậc cao.
Nấm men có nhiều ưu điểm: cho phép sử dụng cả hai loại vector biểu hiện trong prokaryote và trong eukaryote, biểu hiện protein kích thước lớn 50kD, cấu trúc bộ gen có cấu trúc bộ gen của nấm men đã được nghiên cứu đầy đủ, không gây bệnh.
Nấm men có khả năng tạo sản phẩm nhanh, chỉ sau khoảng 8 giờ nuôi cấy đã có sản phẩm protein tái tổ hợp, hiệu xuất biểu hiện gen khá cao (từ 50 mg đến 5000 mg/1lít dịch nuôi cấy).
Các vector biểu hiện trong tế bào nấm men thường có promoter AOX (gen alcohol oxidase) rất mạnh, có khả năng kiểm soát gen cần biểu hiện cao. Biểu hiện gen trong tế bào nấm men có thể thực hiện các phản ứng glycosyl hóa chính xác, phản ứng cắt chuỗi tín hiệu hoặc thay đổi cấu trúc protein sau dịch mã.
1.3.2.4. Biểu hiện gen trong tế bào động vật bậc cao.
Tế bào động vật bậc cao cho phép biểu hiện các prootein có kích thước lớn hơn 50kD. Các vector biểu hiện thường có các promoter mạnh SV 40 CMV cho phép thực hiện các phản ứng glycosyl hóa, hoặc cắt chuỗi tín hiệu chính xác. Tế bào trứng chuột đất vàng Trung Quốc được ứng dụng để sản xuất nhiều loại protein tái tổ hợp sử dụng cho con người do khả năng tạo thành các protein có cấu trúc không gian thích hợp.
Sử dụng hệ thống biểu hiện gen là tế bào động vật bậc cao có một số hạn chế là chỉ có thể biến nạp bằng xung điện, thời gian sàng lọc rất lâu, nuôi cấy phức tạp, giá thành cao.