Hình 3 .3 Kết quả điện di protein tổng số của trên gel SDS-PAGE
Hình 3.8 Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT1 .2 ở các giá trị pH khác nhau
khác nhau
1: thang protein chuẩn, 2-5: protein thu được từ dịch tăng sinh chủng E.coli BL21- pET32/RoTAT1.2 ở pH là 6, 7, 8 và 9
Kết quả hình 3.8 cho thấy, pH môi trường có ảnh hưởng lớn đến khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 của chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT1.2.
Mẫu nuôi cấy với pH môi trường là 9 (đường chạy số 5) có băng protein mờ nhất hay lượng protein thu được là thấp nhất. Ngược lại với các mẫu có pH môi trường là 6,0; 7,0 và 8 (đường chạy 2, 3 và 4), băng protein đích xuất hiện tương đối giống nhau và đậm hơn so với băng protein ở môi trường có pH là 9. Như vậy, trong môi trường có pH 6,0; 7,0 và 8 mức biểu hiện của protein đích biểu hiện tốt và không khác nhau nhiều. Tuy nhiên, chúng tôi cho rằng pH = 7 là pH phù hợp nhất để biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2.
3.3.5. Nghiên cứu xác định nồng độ kháng sinh phù hợp cho sự tổng hợp kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2
Những chủng mang gen mã hóa cho chất kháng kháng sinh Amp thì có khả năng sống sót trong môi trường có Amp. Ở đây, chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT1.2 mang vector tái tổ hợp (được gắn một đoạn gen kháng Amp) có khả năng sống trên môi trường có Amp. Tuy nhiên nồng độ chất kháng sinh có ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của chủng biểu hiện nên việc chọn nồng độ chất kháng sinh thích hợp là điều rất cần thiết. Chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT1.2 được nuôi cấy 3 giờ trong 3 bình tam giác ở điều kiện pH 7, 370C, ở nồng độ Amp trong môi trường (100 g/ml, 150 g/ml và 200 g/ml). Mức độ tổng hợp kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 của chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di SDS-PAGE (hình 3.9).
Hình 3.9. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các nồng độ kháng sinh ampicillin bổ sung vào môi trƣờng
M: thang protein chuẩn, 1-3: protein thu được từ dịch tăng sinh chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT1.2 ở các nồng độ amp là 100 g/ml, 150 g/ml và 200 g/ml
Kết quả điện di trên hình 3.9 cho thấy, cả ba mẫu dịch tăng sinh đều có chưa thành phần protein có trọng lượng là 8 kDa, hình ảnh vạch điện di thành phần protein này có kích thước tương tự nhau có nghĩa là trong môi trường có nồng độ Amp là 100 g/ml, 150 g/ml và 200 g/ml thì khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp của chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT1.2 là như nhau. Như vậy, để thu được kháng nguyên RoTAT 1.2, nồng độ Amp là 100 g/ml là thích hợp để biểu hiện kháng nguyên từ chủng vi khuẩn này.
3.3.6. Nghiên cứu ảnh hƣởng của IPTG đến sự tổng hợp kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2
IPTG (isopropyl -D-thiogalactoside) là chất cảm ứng đối với T7 lac promoter. Promoter này điều khiển trực tiếp quá trình biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2. Vì vậy, IPTG đóng vai trò mấu chốt đến khả năng tổng hợp protein tái tổ hợp RoTAT 1.2. Để làm sáng tỏ sự ảnh hưởng của chất này đến kết quả tổng hợp kháng nguyên RoTAT 1.2, IPTG được bổ sung vào môi trường với các nồng độ từ 1 - 3 mM. Chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT1.2 được nuôi cấy ở các điều kiện pH 7, thời gian tăng sinh 3 giờ, nhiệt độ tăng sinh 370
C, nồng độ kháng sinh ampicillin là 100 g/ml, nồng độ IPTG cảm ứng là 1 mM, 2 mM và 3 mM. Kết quả thí nghiệm được trình bày trong hình 3.10.
Hình 3.10. Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các nồng độ IPTG cảm ứng
M: thang protein chuẩn, 2-5: protein thu được từ dịch tăng sinh chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT1.2 được cảm ứng với các nồng độ IPTG là 3, 2, 1 mM
Kết quả hình 3.10 cho thấy, IPTG có ảnh hưởng rất lớn đến sự biểu hiện protein tái tổ hợp RoTAT 1.2, lượng protein tái tổ hợp tăng tỷ lệ với nồng độ IPTG. Ở nồng độ IPTG là 3 mM cho băng protein là đậm nhất hay lượng protein tái tổ hợp được tổng hợp nhiều nhất. Với mong muốn thu được lượng kháng nguyên tái tổ hợp nhiều nhất, thực tế, chúng tôi đã khảo sát mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 với nồng độ IPTG là 4-6 mM nhưng kết quả cho thấy rằng protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 cũng không được biểu hiện nhiều hơn. Do vậy, nồng độ chất cảm ứng IPTG là 3 mM là thích hợp để biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2.
3.4. Biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2
Sau khi đã lựa chọn các điều kiện nuôi cấy thích hợp, chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT1.2 được nuôi cấy với các điều kiện: pH môi trường là 7; nồng độ Amp là 100 g/ml; nhiệt độ nuôi cấy là 37oC, thời gian tăng sinh 3 giờ sau đó bổ sung IPTG với nồng độ 3 mM để cảm ứng trong 4 giờ, dịch nuôi cấy vi khuẩn được thu, kiểm tra, tinh sạch và kiểm tra khả năng được phát hiện bởi kháng thể đặc hiệu với Trypanosoma
evansi. Kết quả thí nghiệm được trình bày trong các hình 3.11, 3.12, 3.13.
Hình 3.11. Protein thu đƣợc từ dịch nuôi cấy chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT1.2
1-7: protein thu được từ dịch nuôi cấy chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT1.2, M: thang protein chuẩn
Kết quả hình 3.11 cho thấy băng protein ở kích thước 8 kDa xuất hiện rất đậm ở các đường chạy số 1-7 chứng tỏ chủng E. coli BL21- pET32/RoTAT1.2 biểu hiện tốt ở các điều kiện nuôi cấy đã lựa chọn được. Tuy nhiên, hình ảnh điện di đồ cũng thấy rõ: protein tái tổ hợp sau khi biểu hiện thành công vẫn bị lẫn các protein khác. Để thu được protein tinh sạch, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực Ni2+. Protein tái tổ hợp kháng RoTAT 1.2 có chứa 6 gốc histidine. Đây là đuôi Histag được mã hóa bởi các bộ 3 mã hóa nằm trên gen mã hóa kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên RoTAT 1.2 (hình 3.1). Đuôi Histag này có ái lực mạnh đối với Ni2+ nên khi chảy qua cột Ni2+ sẽ gắn kết tạm thời với Ni2+ trong khi các protein khác sẽ được rửa trôi. Protein tái tổ hợp gắn trong cột sắc ký Ni2+ được tách bởi native elution buffer (hình 3.12).