Chƣơng 2 : VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.6Phản ứng ELISA gián tiếp (Yoshihito Kihiwaraki, 2002)
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.6Phản ứng ELISA gián tiếp (Yoshihito Kihiwaraki, 2002)
- Nguyên liệu
+ Đĩa ELISA: đĩa bằng chất liệu nhựa polypropylene có 96 giếng, có khả năng hấp thụ kháng nguyên tốt.
+ Kháng nguyên chuẩn, huyết thanh thỏ, conjugate (chất gắn kết) có gắn enzmyme peroxydase, bubtrate (chất tạo màu phản ứng, thường là TMBZ (3,3’,5,5’ Tetramethybenzodine)), PBS, PBS-Tween, Sữa tách bơ (casein).
+ Máy đọc phản ứng + Các dụng cụ thí nghiệm - Trình tự phản ứng:
Bước 1. Phủ kháng nguyên 100 µl kháng nguyên pha loãng ở nồng độ thích hợp được gắn trực tiếp vào đĩa ELISA. Thời gian ủ kháng nguyên thường là qua đêm ở nhiệt độ 4oC hoặc 37oC trong 2 giờ. Đổ bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline) có chứa Tween 20 (0,05%) rửa đĩa 3 lần, và làm khô.
Bước 2. Phủ đĩa bằng 200 µl dung dịch sữa tách bơ 5% mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ hoặc lắc ở 37oC sau 1 giờ. Đổ bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline) có chứa Tween 20 (0,05%) rửa đĩa 3 lần, và làm khô.
Bước 3. Gắn kháng thể: 100 µl huyết thanh pha loãng ở nồng độ thích hợp bằng dung dịch PBS – sữa tách bơ 5%. Kháng thể ủ trong đĩa ở nhiệt độ 37o C, lắc sau 30 phút. Đổ bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS có chứa Tween 20 (0,05%) rửa đĩa 3 lần, và làm khô.
Bước 4. Kháng thể đặc hiệu loài: 100 µl conjugate pha loãng bằng PBS với độ pha loãng là 10.000 lần, nhỏ mỗi giếng và ủ ở 37oC trong 30 phút. Đổ bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS chứa Tween 20 (0,05%) rửa đĩa 5 lần, và làm khô.
Bước 4. Cơ chất tạo màu: 100µl TMB vào mỗi giếng, để nhiệt độ phòng 15 phút, phản ứng sẽ chuyển sang màu xanh lục nếu là dương tính. Dừng phản ứng bằng dung dịch H2SO4 1M, lúc này phản ứng có màu vàng.
Bước 5. Đọc đĩa trên máy đọc đĩa ELISA ở bước sóng 450 nm.