Hình 3 .3 Kết quả điện di protein tổng số của trên gel SDS-PAGE
Hình 3.13 Phản ứng western blot kiểm tra tính đặc hiệu của protein RoTAT1.2
M: Thang protein chuẩn, 1: kháng nguyên hòa tan của T. evansi với kháng thể đặc hiệu, 2: protein RoTAT 1.2 với kháng thể đặc hiệu của T. evansi
3.5. Nghiên cứu sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 xây dựng quy trình phản ứng ELISA phát hiện bệnh tiên mao trùng
Quy trình ELISA chúng tôi sử dụng là ELISA gián tiếp với các bước như sau:
1. Phủ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 2. Phủ sữa tách bơ
3. Gắn kháng thể đặc hiệu với T. evansi
4. Gắn kháng thể đặc hiệu loài có gắn enzyme (conjugate) 5. Cơ chất sinh màu
Sử dụng phương pháp checkerboard để xác định các thông số của quy trình bao gồm: nồng độ kháng nguyên, độ pha loãng kháng thể, thời gian phủ kháng nguyên, thời gian ủ kháng thể, thời gian ủ kháng thể đặc hiệu loài.
3.5.1 Kết quả xác định hàm lƣợng kháng nguyên và độ pha loãng kháng thể thích hợp cho phản ứng ELISA
Kháng nguyên RoTAT 1.2 được chế tạo bằng công nghệ tái tổ hợp gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của T. evansi trong tế bào E. coli BL21, kháng nguyên này có thể được nhận biết đặc hiệu bởi kháng thể kháng T. evansi. Kháng nguyên RoTAT1.2 được pha loãng và phủ lên đĩa ELISA (Nunc, Mỹ) ở các nồng độ: 15; 20; 25; 30, 35 µg/ml.
Huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu của T. evansi được pha loãng trong PBS theo các tỷ lệ 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600.
Kết quả xác định hàm lượng kháng nguyên và độ pha loãng kháng thể thích hợp cho phản ứng ELISA trong bảng 3.1 cho thấy: giá trị S/N đạt cao nhất là 3,85, tương ứng với nồng độ kháng nguyên RoTAT1.2 là 30 µg/ml, độ pha loãng huyết thanh là 1:400. Đây là các nồng độ được coi là thích hợp nhất cho phản ứng ELISA phát hiện kháng thể đặc hiệu của T. evansi.
Bảng 3.1. Xác định hiệu giá huyết thanh và nồng độ kháng nguyên tối ƣu cho phản ứng ELISA (S/N)
Nồng độ kháng nguyên RoTAT 1.2 (µg/ml)
Độ pha loãng huyết thanh dƣơng chuẩn
1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 15 3,30 3,46 3,08 2,67 2,85 20 3,30 3,43 2,19 2,62 2,57 25 3,21 3,64 3,33 2,78 2,72 30 3,33 3,31 3,85 2,81 3,36 35 2,27 3,43 2,44 2,85 2,58
3.5.2. Khảo sát tác nhân block giếng
Đối với các thử nghiệm miễn dịch lai trên pha rắn như ELISA thì khi tiến hành trên mẫu, các protein không phải là protein mục tiêu có thể gắn lên bề mặt giếng tại những vị trí không có kháng thể phủ giếng và làm giảm độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình. Tác nhân block giếng được sử dụng để hạn chế hiện tượng này.
Các tác nhân block thường sử dụng trong ELISA là các protein như BSA (bovine serum albumin), sữa gầy hoặc casein, gelatin. Trong thí nghiệm này, ba tác nhân block giếng là BSA, sữa tách bơ (skim milk) và gelatin được khảo sát để tìm ra tác nhân block cho tín hiệu nền thấp nhất cho quy trình ELISA, mỗi giá trị nồng độ của một tác nhân block được lặp lại 3 lần. Các giếng trong thí nghiệm này không bổ sung kháng nguyên RoTAT 1.2 mà bổ sung tác nhân block nhằm xem xét tín hiệu nền của phản ứng. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Giá trị OD của phản ứng ELISA với các tác nhân block
Tác nhân block Nồng độ OD Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình ± STD BSA 1% 1,007 0,942 0,93 0,960 ± 0,041 b 3% 0,41 0,402 0,388 0,400 ± 0,011 c 5% 0,279 0,264 0,272 0,272 ± 0,008 d Sữa tách bơ 1% 0,150 0,173 0,154 0,159 ± 0,012 e 3% 0,124 0,122 0,129 0,125 ± 0,003 e 5% 0,099 0,095 0,097 0,097 ± 0,001 e Gelatin 1% 0,187 0,149 0,152 0,163 ± 0,002 a 3% 0,101 0,102 0,099 0,101 ± 0,012 a
(Theo hàng dọc những số mang chữ cái khác nhau có ý nghĩa thống kê)
Giá trị OD thấp nhất đạt được ở nồng độ sữa tách bơ 5% và gelat in 3%. Tuy nhiên, xét về mức độ ổn định của giá trị OD giữa các lần thí nghiệm với các nồng độ khác nhau thì sữa tách bơ thể hiện khả năng hạn chế hiện tượng dương tính giả tốt hơn gelatin. Sự khác biệt về OD giữa ba nồng độ này với các nồng độ còn lại có ý nghĩa thống kê nhưng sự khác biệt giữa chúng thì không có
ý nghĩa thống kê. Vì vậy, chúng tôi chọn sữa tách bơ 5% làm tác nhân block giếng cho quy trình ELISA.
3.5.3 Kết quả xác định thời gian ủ đĩa ELISA với kháng thể đặc hiệu của T.
evansi và anti-bovine IgG:HRPO
Với nồng độ kháng nguyên RoTAT1.2 là 30 µg/ml, ủ đĩa qua đêm ở 4oC. Độ pha loãng huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu của T. evansi là 1:400, phản ứng kháng nguyên-kháng thể được thực hiện ở 370C trong 45, 60, 90, 120 phút. Giá trị OD450 của phản ứng được đo 3 lần cho thấy: tất cả các tỷ lệ S/N tại các thời gian phản ứng đều nằm trong khoảng 3,6-3,8, trong đó giá trị này cao nhất đạt tại thời điểm 90 phút phản ứng. Đây chính là thời gian thích hợp để ủ kháng thể với kháng nguyên.
Hình 3.14. Ảnh hƣởng của thời gian ủ huyết thanh đến kết quả phản ứng ELISA
Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của điều kiện ủ phức hợp phản ứng kháng nguyên-kháng thể và anti-bovine IgG:HRPO được thực hiện trong 30, 45, 60, 90 phút ở nhiệt độ phòng, giá trị OD450 cũng được xác định 3 lần, giá trị S/N của các mẫu phản ứng cũng nằm trong khoảng từ 3,6 đến 3,8 (hình 3.14), trong đó tỷ lệ S/N tại 45 phút là cao nhất, đây chính là thời gian thích hợp để ủ anti-bovine IgG:HRPO với phức hợp kháng thể- kháng nguyên.
Hình 3.15. Ảnh hƣởng của thời gian ủ anti-bovine IgG:HRPO đến kết quả phản ứng ELISA
3.6. Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng ELISA
Đánh giá hiệu quả chẩn đoán của một phương pháp huyết thanh học thì các giá trị độ nhạy và độ đặc hiệu phải được thực hiện trên gia súc gây nhiễm và không gây nhiễm với mầm bệnh. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, số lượng gia súc thí nghiệm không nhiều (3 con trâu gây nhiễm T. evansi và 07 con trâu không gây nhiễm) vì vậy có thể gây sai số khi tính các giá trị này. Để chính xác hơn trong việc xác định độ nhạy và đặc hiệu của phản ứng ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT1.2 để xác định bệnh T. evansi trên trâu ở Việt Nam, chúng tôi sử dụng 52 mẫu huyết thanh trâu thí nghiệm, trong đó có: 18 mẫu dương tính với T. evansi đã được kiểm tra bằng phương pháp tiêm truyền chuột và ELISA với kháng nguyên hòa tan của T. evansi (bao gồm 03 mẫu trâu gây nhiễm với T. evansi), 34 mẫu âm tính với T. evansi (bao gồm 07 mẫu trâu không gây nhiễm T. evansi, đã được điều trị Berenil và kiểm tra huyết thanh âm tính với T. evansi trong 1 tháng) được sử dụng để thiết lập phản ứng ELISA chẩn đoán bệnh T. evansi bằng kháng nguyên RoTAT 1.2. Kết quả phản ứng ELISA được thể hiện ở bảng 3.7.
Bảng 3.3. Kết quả phản ứng ELISA để xác định độ nhạy và đặc hiệu
Kết quả
Các mẫu huyết thanh trâu nhiễm T.
evansi
Các mẫu huyết thanh trâu không nhiễm T.
evansi Tổng số Xét nghiệm (+) 17 2 08 Xét nghiệm (-) 1 32 02 Tổng số 18 34 10
Từ 18 mẫu máu trâu dương tính với T. evansi có 17 mẫu dương tính với phản ứng ELISA sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT1.2, điều đáng chú ý là 03 mẫu máu trâu gây nhiễm với T. evansi phân lập được từ Lạng Sơn đều có kết quả dương tính. Tương tự như vậy, trong 32/34 mẫu máu trâu âm tính với T. evansi và phản ứng ELISA cũng bao gồm 07 mẫu máu trâu không gây nhiễm T. evansi. Kết quả trên cho phép phát hiện độ nhạy của phản ứng (Se) là 94,12%, độ đặc hiệu của phản ứng (Sp) là 99,44%.
3.7. Xác định mức độ lặp lại của kết quả phản ứng
10 mẫu huyết thanh trâu được lấy ngẫu nhiên để thực hiện 5 lần phản ứng ELISA với kháng nguyên RoTAT1.2 ở các điều kiện như nhau. Kết quả phản ứng được đo tại bước sóng 450 nm.
Bảng 3.4. Kết quả xác định mức độ lặp lại kết quả phản ứng ELISA Mẫu Mẫu
huyết thanh
Kết quả ELISA OD450 Giá trị trung bình CV(%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 1 0,203 0,199 0,186 0,217 0,217 0,204 6,41 2 0,075 0,072 0,069 0,071 0,068 0,071 3,86 3 0,217 0,217 0,198 0,203 0,199 0,207 4,59 4 0,181 0,192 0,187 0,184 0,194 0,187 2,89 5 0,096 0,111 0,099 0,125 0,118 0,109 11,22 6 0,091 0,094 0,092 0,087 0,084 0,09 4,51 7 0,068 0,063 0.0 0,061 0,069 0,064 0,065 5,22 8 0,195 0,201 0,198 0,197 0,199 0 ,198 1,13 9 0,468 0,453 0,487 0,467 0,417 0,458 5,70 10 0,071 0,075 0,068 0,069 0,072 0,071 3,86
Kết quả trong bảng 3.8 cho thấy, hệ số biến động (CV) cao nhất là 11,22%, hệ số này càng cao thì sự sai khác giữa các lần phản ứng càng lớn. Xác định sự sai khác giữa các lần lặp cho thấy, phản ứng ELISA để chẩn đoán bệnh T. evansi dựa vào kháng nguyên RoTAT1.2 cho kết quả hoàn toàn tương đương nhau giữa các lần thí nghiệm.
3.7.1. Đánh giá khả năng phát hiện của bệnh của phản ứng ELISA trên mẫu máu trâu, bò nghi nhiễm tiên mao trùng máu trâu, bò nghi nhiễm tiên mao trùng
Trong phản ứng ELISA, một mẫu huyết thanh được xem là có tương tác đặc hiệu nhấtvới một kháng nguyên khi giá trị OD của mẫu đó lớn hơn một giá trị ngưỡng (cut-off) đáng tin cậy. Thông thường, giá trị ngưỡng được tính dựa trên giá trị OD trung bình của một lượng lớn các mẫu âm tính với kháng nguyên mục tiêu. Số mẫu âm càng lớn thì giá trị ngưỡng càng đáng tin cậy.
Công thức xác định giá trị ngưỡng (cut off):
Cut off = OD trung bình của các mẫu âm + 2* STD lớn nhất của các mẫu âm
Số mẫu âm mà chúng tôi sử dụng dể tính giá trị ngưỡng là 15 mẫu. Giá trị ngưỡng tính được là 0,63.
Huyết thanh của trâu, bò nghi nhiễm bệnh tiên mao trùng được giữ trong tủ - 800C. 60 mẫu huyết thanh gồm 46 mẫu huyết thanh trâu và 14 mẫu huyết thanh bò được thu thập để phát hiện kháng thể đặc hiệu của T. evansi. Các mẫu máu của những con trâu,bò này được kiểm tra song song bằng phương pháp PCR để so sánh hiệu quả phát hiện. Kết quả được trình bày trong bảng 3.9.
Bảng 3.5. Kết quả xác định trâu, bò nhiễm bệnh tiên mao trùng bằng phƣơng pháp ELISA và PCR Kết quả phản ứng ELISA Kết quả phản ứng PCR Số mẫu dƣơng tính Số mẫu âm tính Tổng số Số mẫu dương tính 6 3 9 Số mẫu âm tính 2 49 51 Tổng số 8 52 60
Với 60 mẫu huyết thanh trâu, bò thu thập ngoài thực địa, phản ứng PCR đã phát hiện được 8 mẫu dương tính và 52 mẫu âm tính, tỷ lệ phát hiện dương tính đạt 13,3%; trong khi đó, phản ứng ELISA phát hiện được 9 mẫu dương tính và 51 mẫu âm tính, tỷ lệ phát hiện dược tính đạt 15%. So với phương pháp PCR, tỷ lệ trùng hợp ngẫu nhiên của các mẫu dương tính ELISA là: 6/(6+2) x 100%= 75% , tỷ lệ trùng hợp ngẫu nhiên của các mẫu âm tính ELISA là 49/(49+3) x 100%= 94%, tỷ lệ trùng hợp ngẫu nhiên tổng số là: (6+49)/60* 100%= 91,7%. Trong nghiên cứu này, độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ELISA đạt tới 94,12% và 99,44% và theo Holland, 2001[26]: độ nhạy của phản ứng PCR là 78,2%, độ đặc hiệu là 100%. Trong thực tế, ELISA là phương pháp phát hiện gián tiếp bệnh tiên mao trùng thông qua sự có mặt của kháng thể đặc hiệu với T. evansi trong khi đó PCR là phương pháp phát hiện trực tiếp sự có mặt của ký sinh trùng trong máu của vật chủ. Vì vậy, khi con vật mới mắc bệnh trong khoảng 1 tuần đầu, hàm lượng kháng thể tạo ra thấp có thể dẫn tới hiện tượng âm tính giả với phản ứng ELISA. Các trường hợp vật chủ mới khỏi bệnh, ký sinh trùng không còn tồn tại trong cơ thể nhưng kháng thể đặc hiệu vẫn tồn lưu trong máu dẫn tới hiện tượng dương tính giả của ELISA. Mặc dù vậy, phản ứng ELISA có ưu điểm nổi trội đó là có thể xét nghiệm cùng lúc nhiều mẫu bệnh phẩm, thời gian xét nghiệm nhanh, quy trình thực hiện đơn giản.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
Quaquá trình nghiên cứu đề tài chúng tôi đã thu được những kết quả sau:
1 - Xác được các điều kiện nuôi cấy chủng E. coli BL21/pET – RoTAT theo phương pháp biến nạp dịch nuôi cấy được trải trên đĩa môi trường LB thạch có bổ sung chất kháng sinhAmpicillin 100 mg/ml và nuôi ở 37oC qua đêm.
2 - Biểu hiện được gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp đặc hiệu của kháng nguyên RoTAT 1.2, trong đó:
Xác định được thời gian tăng sinh của chủng biểu hiện tốt nhất là 4 giờ. Xác định được nhiệt độ tăng sinh của chủng biểu hiện ở 37o
C là phù hợp nhất. Xác định được mối tương quan giữa mật độ vi khuẩn và mức độ biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 không ảnh hưởng nhiều tới mức độ biểu hiện.
Xác định được độ pH phù hợp để chủng E. coli BL21 – pET32(+) sinh tổng hợp protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 là khoảng 6 – 8.
Xác định được nồng độ kháng Amp là 100 g/ml là thích hợp để biểu hiện kháng nguyên từ chủng vi khuẩn này.
Xác định được ảnh hưởng của chất cảm ứng IPGT đến sự tổng hợp kháng nguyên tái tổ hợp ở nồng độ 3mM là thích hợp để biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp.
3 - Biểu hiện và tinh sạch thành công kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 (kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 của T. evansi đã được chế tạo thành công bằng công nghệ tái tổ hợp gen).
4 - Thiết lập thành công KIT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trên trâu bò. Xác định được hàm lượng kháng nguyên RoTAT 1.2 là 30 g/ml và độ pha loãng kháng thể là 1: 400 thích hợp cho phản ứng ELISA.
Khảo sát tác nhân block giếng cho thấy sữa tách bơ 5% là hạn chế được hiện tượng dương tính giả trong phản ứng ELISA.
Xác định được thời gian thích hợp ủ kháng nguyên với kháng thể là 90 phút và thời gian ủ anti-bovine IgG:HRPO với phức hợp kháng nguyên kháng thể là 45 phút.
Xác định được độ nhạy của phản ứng (Se) là 94,12% và độ đặc hiệu (Sp) của phản ứng ELISA là 99,44%.
Xác định được mức độ lặp lại của kết quả phản ứng cho kết quả là tương đương nhau giữa các lần thí nghiệm.
5. Đánh giá được khả năng phát hiện của bệnh của phản ứng ELISA trên mẫu máu trâu, bò nghi nhiễm tiên mao trùng bằng cách so sánh với phản ứng PCR cho kết quả trùng hợp ngẫu nhiên của các mẫu dương tính là 75%, âm tính là 94%và tổng số là 91,7%.
2. Đề nghị
Tiếp tục nghiên cứu chế tạo kháng nguyên tái tổ hợp phục vụ cho việc sản xuất Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho gia súc ở Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đái Duy Ban, Lữ Thị Cẩm Vân (1994), Công nghệ gen và công nghệ sinh học
ứng dụng trong nông nghiệp hiện đại. Nxb nông nghiệp, Hà Nội
2. Phạm Chiến, Nguyễn Đức Tân, Lê Đức Quyết (1999), “Kết quả khảo sát ký sinh trùng đường máu trên đàn bò ở huyện Mi Dinh Daklak", Kết quả hoạt động KHKT Thú y, tr. 53
3. Phan Văn Chinh (2006), Bệnh tiên mao trùng do Trypanosoma evansi ở trâu,
bò nuôi tại các tỉnh miền Trung và biện pháp phòng trị, Luận án Tiến sĩ nông
nghiệp, Hà Nội.
4. Nguyễn Quốc Doanh (1999), Một số đặc tính sinh học của T. evansi (Steel, 1885), bệnh học do chúng gây ra, quy trình bảo quản và sử dụng giống T.
evansi để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng, Luận án Tiến sĩ nông nghiệp, Hà
Nội.
5. Lương Văn Huấn, Lê Hữu Khương (1997), Ký sinh và bệnh ký sinh ở gia súc,
gia cầm, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia – TP.HCM.
6. Nguyễn Đăng Khải (1995), "Về triệu chứng sảy thai trong bệnh tiên mao trùng trâu bò do T. evansi", Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, tập III,số 1, tr. 69 - 71.