(Nguồn: Riss T.L, Moravec R.A, 2013) [34].
Thử nghiệm o tế bào dòng chảy (Flow Cytometric Assay) kết hợp với máy ếm tế bào
Kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy bắt nguồn từ phát minh của Lou Herzenberg năm 1969, với thiết bị phân loại tế bào dựa vào việc sử dụng ánh sáng huỳnh quang.
Phân tích tế bào theo dòng chảy là một kỹ thuật sinh lý dựa trên laser, đƣợc sử dụng để đếm tế bào, phân loại tế bào, nhận diện dấu sinh học và kỹ thuật protein, bằng cách đƣa tế bào vào một dòng chất lỏng, sau đó cho đi qua một thiết bị dò điện tử. Kỹ thuật này cho phép đồng thời phân tích đa thông số các đặc tính vật lý và hóa học với tốc độ có thể lên đến hàng ngàn hạt mỗi giây. Đếm tế bào đƣợc thực hiện trên hệ thống lõi gồm 3 phần: hệ thống tạo dòng chất lỏng, hệ thống quang học và hệ thống điện tử. Hệ thống tạo dòng chất lỏng cho phép các tế bào từ mẫu xét nghiệm có thể di chuyển thành một
30
dòng đơn lẻ. Các tế bào đƣợc phân tích đƣợc nhuộm bằng thuốc nhuộm huỳnh quang làm chất chỉ thị nhạy cảm để phát hiện và phân biệt phát ánh sáng ở các bƣớc sóng khác nhau. Hệ thống quang học sẽ kích thích và thu nhận các tín hiệu ánh sáng từ các tế bào này thông qua các đèn laser và kính lọc đơn sắc. Các tia laser đƣợc sử dụng trong phép đo tế bào dòng chảy có sẵn ở các bƣớc sóng khác nhau với các mức công suất khác nhau. Tín hiệu quang học này sau đó sẽ đƣợc khuếch đại và chuyển đổi thành tín hiệu số nhờ hệ thống điện tử.
Thử nghiệm đo tế bào dòng chảy là một xét nghiệm rất nhạy, hiệu quả. Phƣơng pháp này sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang làm chất chỉ thị để phát hiện và phân biệt khả năng sống sót của tế bào. Thử nghiệm đo tế bào dòng chảy đã đƣợc phát triển để đo số lƣợng sống sót của M. bovis [35].
Tổng số tế bào trong vắc xin BCG đƣợc đo trực tiếp bằng máy đếm Coulter Z1 hoặc đếm bằng Fluorespheres đếm dòng chảy tế bào trong quá trình xét nghiệm.
Ƣu iểm:
Độ nhạy cao trong việc đếm tế bào vi khuẩn
Có thể đo đƣợc kích thƣớc và hàm lƣợng vi khuẩn với tốc độ 1.000 tế bào/giây
Thời gian đếm tế bào nhanh (4 giờ cho 1 thử nghiệm)
Nhƣợc iểm:
Ngoài tế bào sống sót còn có các tế bào chết dƣơng tính giả ảnh hƣởng đến độ chính xác của kết quả [30; 36].
31
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
2.1.1. Địa iểm nghi n cứu
Phòng sản xuất vắc xin BCG – Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế
2.1.2. Thời gian nghi n cứu
Từ 01/2019 đến 12/2021 2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.2.1. Các mẫu ống 2ml màu nâu có ịnh vị bẻ ƣợc của hãng Schott 2.2.2.Vắc xin BCG ƣợc ông khô trong ống 2ml có ịnh vị bẻ ƣợc ã xác ịnh ƣợc thông số kỹ thuật
2.2.3. Động vật thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng, trọng lƣợng 18- 22g/con - Chuột lang, trọng lƣợng 250- 350g/con
- Tất cả các động vật thí nghiệm đƣợc nuôi tại cơ sở chăn nuôi Suối Dầu của Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế. Động vật thí nghiệm đƣợc giám sát tác nhân gây bệnh, kiểm soát thức ăn, nƣớc uống. Đƣợc nuôi cách ly và đảm bảo chƣa từng đƣợc sử dụng cho mục đích thí nghiệm nào trƣớc đó.
2.2.4. Hóa chất
- L-Asparagine (Sigma - Đức)
- MgSO4.7H2O (Merck - Mỹ)
- K2HPO4 (Merck - Mỹ)
- Ammonium iron (III) (Merck - Mỹ)
- ZnSO4 1,55% (Merck - Mỹ)
- Glycerol (Kanto - Nhật)
- KH2PO4 (Merck - Mỹ)
- Bột khoai tây (Sigma - Đức)
- Malachite oxalate (Merck - Mỹ)
32
2.3. NHÀ XƢỞNG VÀ THIẾT BỊ DỤNG CỤ
2.3.1. Nhà xƣởng
Nhà sản xuất vắc xin BCG, đạt tiêu chuẩn GMP – WHO.
Nhà chăn nuôi động vật thí nghiệm, phòng Kiểm định và đạt tiêu chuẩn GLP - WHO (IVAC).
2.3.2. Thiết bị
- Laminar Regavolt (Anh)
- Lò hấp môi trƣờng Jouan (Pháp)
- Tủ ấm Memmert (Đức)
- Máy đông khô CNME (Trung Quốc)
- Tủ ấm Thermosi (Pháp)
- Tủ lạnh âm GFL (Đức)
- Máy hàn chân không Kumabe (Nhật) - Tủ sấy 2 cửa Memmert (Đức) - Cân phân tích Satorius (Đức)
- Máy khuấy từ IKA (Đức)
- Máy lắc schweiz (Pháp)
- Máy nghiền Oledich (Đan Mạch) - Máy đo độ ẩm tồn dƣ Nakajima (Nhật) - Máy kiểm tra chân không Tesla- Coil (Nhật) - Máy quang phổ kế Thermo Genesys 10UV (Mỹ) - Máy súc rửa Bausch+Strolbel (Đức)
2.3.3. Dụng cụ
- Syringe Cornwall (Thụy Sĩ)
- Ống đong 100 ml (Duran- Đức)
- Tube vặn 20, bình chiết trứng (Pyrex- Đức) - Bình cầu 250ml – 500ml – 1000ml (Duran - Đức) - Pipette nhựa 1ml- 2ml- 10ml (Falcon - Mỹ) - Bình tam giác 250ml, 500ml, 1000ml (Duran - Đức) - Pipette thủy tinh 1ml- 2ml- 10ml (Duran - Đức)
33 2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thiết kế nghi n cứu
Hình 2.1. Sơ ồ nghi n cứu tổng quát
Lựa chọn đƣợc loại ống Lựa chọn loại ống phù hợp với thiết bị Đông khô thử nghiệm 6 lô Xác định thông số kỹ thuật Kiểm tra chất lƣợng vắc xin Thống kê tỷ lệ loại bỏ Sản xuất vắc xin BCG trên ống có định vị bẻ đƣợc Sản xuất thử nghiệm 3 lô Giám sát chất lƣợng 60 lô Đánh giá chất lƣợng dựa trên các tiêu chuẩn xuất xƣởng Chất lƣợng sau sản xuất Xác định loại ống có định vị bẻ đƣợc Nghiên cứu tính ổn định vắc xin BCG Nghiên cứu độ ổn định theo thời gian
thực 1.Độ sống 2. Ổn định nhiệt 3. Độ ẩm tồn dƣ 4. Chân không 5. Cảm quan 6. Tốc độ tạo huyền dịch đồng nhất
34
2.4.1. Xác ịnh loại ống 2ml có ịnh vị bẻ ƣợc phù hợp với thiết bị hiện có của IVAC
2.4.1.1. Lựa chọn và xác định thông số kỹ thuật của loại ống 2ml có định vị bẻ được định vị bẻ được
Ống 2ml có định vị bẻ đƣợc đƣợc cung cấp bởi nhà sản xuất Schott của Đức. Để xác định thông số kỹ thuật cho ống 2 ml có định vị bẻ đƣợc, chúng tôi phối hợp cùng với nhà sản xuất Schott chọn 2 loại ống để thử nghiệm: ống có khứa sẵn tại một vị trí trên cổ ống để dễ bẻ (OPC) và ống có một vòng sơn bằng men sứ tại vị trí cổ ống để làm yếu thủy tinh, dễ bẻ (CBR). Chúng tôi trao đổi nhiều lần và điều chỉnh cho phù hợp với các thiết bị và công nghệ sản xuất vắc xin BCG tại IVAC.
Các mẫu ống 2ml có định vị bẻ đƣợc đƣợc đánh giá qua 6 bƣớc sau:
Hình 2.2. Các bƣớc l a chọn ống 2 ml có ịnh vị bẻ ƣợc hãng Schott
Đánh giá cảm quan
Tỷ lệ bể vỡ
Kiểm tra các thông số kỹ thuật cơ bản Tỷ lệ loại bỏ trong quá trình sử dụng thử trên thiết bị Tỷ lệ bẻ thành công Kiểm tra chất lƣợng nguyên liệu đầu
Ống 2ml có định vị
35
Bảng 2. 1. Ti u chuẩn ánh giá các thông số kỹ thuật của ống 2 ml có ịnh vị bẻ ƣợc của hãng Schott
STT Tiêu chí đánh giá Tiêu chuẩn cơ sở
1 Đánh giá cảm quan
Màu sắc trên cùng 1 ống và giữa các ống phải nhƣ nhau. Hình dạng các ống đồng đều khi quan sát bằng mắt
2 Tỷ lệ bể vỡ do vận
chuyển 0%
3 Kiểm tra các thông số kỹ thuật cơ bản
Theo bản vẽ thiết kế kỹ thuật của các mẫu ống tiêm và đo thực tế bằng thƣớc kỹ thuật các thông số cơ bản gồm: h1, h4, d1, d2, d3, d7, so sánh với tiêu chuẩn kỹ thuật nguyên liệu đầu(*)
4
Tính tỷ lệ loại bỏ ống trong quá trình sử dụng thử trên thiết bị (giai đoạn súc rửa, phân ống, hàn ống).
≤ 7%
5 Tỷ lệ bẻ thành công 100% các ống đều bẻ đƣợc khi bẻ thử (**) 6 Kiểm tra chất lƣợng
nguyên liệu đầu
Đạt tiêu chuẩn chất lƣợng nguyên liệu đầu cho ống tiêm sản xuất vắc xin BCG
(*): Ti u chuẩn kỹ thuật nguy n liệu ầu
h1: tổng chiều cao của ống tiêm. h4: chiều cao bầu chứa.
d1: đƣờng kính thân.
d2: đƣờng kính cổ ống (vị trí bẻ gãy). d3: đƣờng kính bầu trên.
36
Hình 2.3. Bản vẽ thiết kế kỹ thuật ống 2 ml có ịnh vị bẻ ƣợc
(**): Phƣơng pháp đánh giá tỷ lệ bẻ thành công: bẻ thử, số lƣợng mẫu 500 ống, 10 ngƣời bẻ, phân làm 2 nhóm: 5 nam và 5 nữ, mỗi ngƣời bẻ 50 ống.
Đánh giá tỷ lệ bẻ thành công ống 2 ml có định vị bẻ đƣợc.
2.4.1.2. Đông khô thử nghiệm vắc xin BCG trên ống 2ml đã xác định thông số kỹ thuật thông số kỹ thuật
Ống 2ml có định vị bẻ đƣợc đã xác định đƣợc thông số kỹ thuật phù hợp với trang thiết bị hiện có tại IVAC: máy súc rửa Bausch+Strolbel, syringe Cornwall, máy hàn chân không Kumabe ES-1500. Chúng tôi tiến hành đông khô thử nghiệm 6 lô vắc xin BCG trên ống 2ml có định vị bẻ đƣợc. Sử dụng cùng một lô vắc xin BCG bán thành phẩm, tách riêng 1 phần để phân liều và đông khô trên ống 2ml có định vị bẻ đƣợc (gọi là lô thí nghiệm – TN). Mỗi lô thí nghiệm (TN) đông khô 400 ống. Phần vắc xin BCG bán thành phẩm còn lại đƣợc thực hiện theo quy trình chuẩn sản xuất vắc xin BCG của IVAC (gọi là lô đối chứng - ĐC). Mỗi lô đối chứng (ĐC) khoảng 7000 ống.
Đông khô thử nghiệm 6 lô thí nghiệm liên tiếp (TN1, TN2, TN3, TN4, TN5 và TN6) và 6 lô đối chứng tƣơng ứng (ĐC1, ĐC2, ĐC3, ĐC4 và ĐC6). Các lô thí nghiệm và lô đối chứng đƣợc phân liều, đông khô và hàn ống trong cùng điều kiện.
37
Sơ đồ qui trình sản xuất và kiểm định vắc xin BCG
Hình 2.4. Sơ ồ quy trình sản xuất vắc xin BCG (Nguồn: Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế, 2020) [37].
Chủng gốc 1173 P2 Lot C/WS Cảm quan, vô trùng -Vô trùng -An toàn đặc hiệu -Vô trùng - Mật độ quang - Độ phân tán - Độ sống tƣơi - Vô trùng tƣơi Kiểm tra -Vô trùng - Nhận dạng
-An toàn không đặc hiệu -Mật độ quang -Độ phân tán -Cảm quan -Độ ẩm tồn dƣ -Tốc độ tạo huyền dịch đồng nhất -Chân không -Độ sống -Ổn định nhiệt Kiểm định
Giai đoạn nuôi cấy, pha chế vắc xin tƣơi
Giai đoạn đông khô, hàn ống chân không
Giai đoạn đóng gói thành phẩm
Nhân chủng
Cấy chuyền sản xuất
Gặt, nghiền sinh khối
Pha chế vắc xin tƣơi
Phân ống 2ml có định vị bẻ đƣợc và không bẻ đƣợc Đông khô Hàn ống chân không Đóng gói Biệt trữ
38
Qui trình sản xuất vắc xin BCG
Nhân chủng (S1): Đƣa BCG từ ống chủng sản xuất 1173 P2 lot C/WS vào môi trƣờng Sauton, theo dõi 21 ngày ở nhiệt độ 37 ±1o
C. Quan sát màng BCG khô, có màu vàng nhạt, xếp đều đặn trên bề mặt bình Sauton. Tiến hành cấy chuyền sản xuất.
Cấy chuyền sản xuất (S2): Chuyền màng BCG từ bình S1 sang môi trƣờng Sauton. Tiêu chuẩn đánh giá trƣớc khi gặt: màng BCG màu vàng tƣơi, mọc dày, xếp đều đặn trên bề mặt bình Sauton.
Gặt, pha chế vắc xin tươi: màng BCG (S2 ) sau 6-7 ngày trên môi trƣờng Sauton đạt tiêu chuẩn về cảm quan (màu sắc, độ leo), gặt thu sinh khối bằng bộ lọc Birkhaug. Đƣa sinh khối vào nghiền và pha với Glutamate Natri 1,5% để có đậm độ 50mg/ml.
Pha bán thành phẩm: Vắc xin BCG đƣợc pha với tá chất Glutamat Natri 1,5% để có đậm độ 2,5mg/ml
Phân ống: Quá trình phân ống đƣợc thực hiện theo qui trình chuẩn sản
xuất vắc xin BCG của IVAC, bằng bơm tiêm phân liều (Syringe Cornwall) đã đƣợc chuẩn định. Trong suốt quá trình phân ống vắc xin BCG phải đƣợc đặt lên trên máy khuấy từ và giữ ở nhiệt độ 2-8oC. Sau khi phân ống, dùng máy lắc đều để vắc xin BCG không bị lắng trƣớc khi làm đông.
Đông khô: Vắc xin BCG đƣợc đƣa vào đông khô trên máy đông khô CNME với 2 giai đoạn làm đông và làm khô. Giai đoạn làm đông đƣợc thể hiện ở 2 cấp:
o Làm đông cấp I ở nhiệt độ -30oC trong 4 -6 giờ o Làm đông cấp II ở -42oC, thời gian làm đông ≥ 8 giờ
Tổng thời gian của giai đoạn làm đông không đƣợc ít hơn 12 giờ và nhiệt độ sau cùng vắc xin BCG kết thúc giai đoạn làm đông là -38oC ± 2o
C. -Vắc xin BCG đƣợc làm khô trong điều kiện chân không và cũng đƣợc thực hiện 2 cấp:
oLàm khô cấp I (giai đoạn tách nƣớc tự do): từ 4 - 5 giờ trong điều kiện chân không ≤ 20 Pa và nhiệt độ giàn ngƣng tụ ≤ -50oC. Nhiệt độ vắc xin
39
trong giai đoạn này sẽ tăng dần, khi kết thúc giai đoạn làm khô cấp I, chân không trong buồng máy đông khô giảm xuống ≤ 6 Pa chuyển sang làm khô cấp II.
oLàm khô cấp II (giai đoạn tách nƣớc liên kết): giai đoạn này nhiệt độ đƣợc kích hoạt tăng lên, nhiệt độ sau cùng của vắc xin tùy thuộc vào nhiệt độ này. Nhiệt độ sau cùng của vắc xin đƣợc xác định là nhiệt độ khi kết thúc quá trình đông khô.
Hàn ống: Các ống vắc xin đƣa vào hàn kín trên máy hàn chân không KUMABE ES-1500. Tỉ lệ loại bỏ chân không lúc hàn không quá 2%.
Đóng gói: Vắc xin BCG đƣợc kểm tra cảm quan, kiểm tra chân không trƣớc khi đóng hộp. Một hộp vắc xin chứa 20 ống, mỗi ống 10 liều.
Biệt trữ: Vắc xin BCG trƣớc khi xuất xƣởng đƣợc kiểm tra các chỉ tiêu: vô trùng, nhận dạng, an toàn không đặc hiệu, mật độ quang, độ phân tán, cảm quan, độ ẩm tồn dƣ, tốc độ tạo huyền dịch đồng nhất, chân không, độ sống, ổn định nhiệt.
Vắc xin BCG đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 2-8oC, hạn dùng 30 tháng.
Đánh giá kết quả:
- Tất cả 6 lô vắc xin BCG thử nghiệm và 6 lô đối chứng đƣợc đánh giá chất lƣợng theo tiêu chuẩn xuất xƣởng [10; 30].
- Thống kê tỷ lệ loại bỏ trong suốt quá trình sản xuất bao gồm: tỷ lệ phần trăm gãy vỡ trong quá trình súc rửa, hàn ống, kiểm tra vật lý, tỷ lệ loại do không đạt chân không. So sánh với tỷ lệ loại bỏ của ống sử dụng vật liệu tạo vết khứa để bẻ đang sử dụng hiện nay qua các giai đoạn.
2.4.2. Sản xuất thử nghiệm và giám sát chất lƣợng vắc xin BCG sản xuất tr n ống 2ml có ịnh vị bẻ ƣợc xuất tr n ống 2ml có ịnh vị bẻ ƣợc
2.4.2.1. Sản xuất thử nghiệm vắc xin BCG trong ống 2ml có định vị bẻ được
- Sau khi đã xác định và chọn lựa đƣợc loại ống 2ml có định vị bẻ đƣợc phù hợp, tiến hành sản xuất 3 lô vắc xin BCG, 14000 ống/lô (tƣơng đƣơng cỡ lô sản xuất thƣờng qui) theo qui trình sản xuất nhƣ mô tả ở sơ đồ 2.3
40 - Các bƣớc thực hiện:
Kiểm tra chất lƣợng của 3 lô vắc xin BCG đông khô trên ống 2ml có định vị bẻ đƣợc theo các chỉ tiêu của TCCL dùng cho xuất xƣởng vắc xin (WHO.TRS 979, 2013 và DĐVN V, 2017).
- Đánh giá kết quả:
Đánh giá kết quả thu đƣợc theo tiêu chuẩn xuất xƣởng vắc xin BCG (WHO.TRS 979, 2013 và DĐVN V, 2017).
Bảng 2.2. Ti u chuẩn xuất xƣởng của vắc xin BCG
STT Chỉ ti u Phƣơng pháp Ti u chuẩn
chấp nhận Tài liệu tham chiếu
01 Độ sống sau đông
khô Nuôi cấy 1 - 6 x 106 đvs/mg DĐVN V, 2017
02 Tính ổn định nhiệt Nuôi cấy ≥ 20% TRS 979, 2013
03 Dạng vật lý Quan sát bằng
mắt
Dạng bột trắng khô,
bong, không teo. DĐVN V, 2017
04 Tốc độ tạo huyền dịch đồng nhất Quan sát bằng mắt Dễ tan, nhanh chóng tạo thành huyền dịch đồng nhất sau 1 phút. DĐVN V, 2017
05 Mật độ quang Đo quang
(λ = 490nm) ≤ 0,5 DĐVN V, 2017
06 Độ phân tán Đo quang ≥ 0,9 DĐVN V, 2017
07 Chân không Máy Tesla -
Coil
100% ống đạt chân
không DĐVN V, 2017
08 Độ ẩm tồn dƣ Abderhalden
(đo máy) ≤ 3% DĐVN V, 2017
09 An toàn đặc hiệu Thử trên
chuột lang
Ít nhất 2/3 số chuột khoẻ mạnh, lên cân. Toàn bộ chuột lang thí nghiệm không có biểu hiện lao tiến triển sau 6 tuần theo dõi.
TRS 979, 2013 DĐVN V, 2017
41