CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP KIỂM ĐỊNH ĐỘ SỐNG VẮC XIN BCG
1.5.1. Tính ổn ịnh v ộ sống của vắc xin BCG
1.5.1.1. Yêu cầu về độ sống
Thử nghiệm kiểm tra độ sống (công hiệu) của vắc xin BCG đóng vai trò trung tâm trong việc kiểm tra chất lƣợng vắc xin BCG và đảm bảo rằng các lô vắc xin BCG đồng nhất về các tiêu chí đã xác định trƣớc.
Chất lƣợng vắc xin dƣợc duy trì tính an toàn, hiệu quả bảo vệ, các tiêu chuẩn kỹ thuật của nó đến thời điểm cuối của hạn dùng.
1.5.1.2. Các phương pháp xác định độ sống
Phƣơng pháp chuẩn thức: Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên môi trƣờng Lowenstein Jensen
Độ sống vắc xin BCG là số lƣợng khuẩn lạc BCG sống trên môi trƣờng Lowenstein Jensen.
Vắc xin BCG đƣợc hoàn nguyên với nƣớc muối sinh lý hoặc dung dịch sauton 1/4. Pha loãng ở các nồng độ thích hợp, sau đó cấy vào các ống môi trƣờng Lowenstein Jensen. Môi trƣờng đã cấy vi khuẩn Mycobacterium bovis
BCG, đem ủ vào tủ ấm 37oC sau 28 ngày, đọc kết quả.
Đếm số lƣợng khuẩn lạc sống mọc trên môi trƣờng LJ. Số đơn vị sống đƣợc tính bằng chƣơng trình WHO Program BCG – Biopharma do WHO cung cấp. Các lô vắc xin BCG đạt chất lƣợng phải có độ sống nằm trong tiêu chuẩn xuất xƣởng theo WHO-TRS 979 và dƣợc điển Việt Nam V, 2017 [10; 30].
Hiện tại, kiểm tra công hiệu bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên môi trƣờng Lowenstein Jensen tại IVAC là phƣơng pháp kiểm tra công hiệu duy nhất để xác định số lƣợng tế bào sống trong vắc xin BCG, phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên môi trƣờng LJ là phƣơng pháp chuẩn đƣợc WHO khuyến nghị [21; 27].
28
Ƣu iểm
- Quan sát đƣợc đặc điểm sinh trƣởng và hình thái khuẩn lạc trên môi trƣờng Lowenstein Jensen.
Nhƣợc iểm
- Có thể bị sai số do quá trình pha loãng
- Thời gian hình thành khuẩn lạc lâu (3-4 tuần) do tốc độ phát triển của vi khuẩn Mycobacterium bovis BCG chậm.
Thử nghiệm phát quang sinh học ATP (ATP Bioluminescence Assay) Adenosine triphosphate (ATP) là phân tử đƣợc sử dụng để dự trữ năng lƣợng cho tất cả các loại tế bào sống (động vật, thực vật, vi khuẩn, nấm men và nấm mốc). ATP truyền năng lƣợng trong tế bào sống để cung cấp năng lƣợng cho các enzym cần thiết cho các chức năng của tế bào. Sau khi tế bào chết, ATP bị phân hủy bằng cách tự phân trong vòng vài phút [31].
Thử nghiệm phát quang sinh học ATP lần đầu tiên đƣợc phát hiện và những năm 1950 bởi các nhà khoa học NASA, những ngƣời quan tâm đến sự sống, tế bào sống trên 1 một hành tinh khác. Thử nghiệm này đƣợc sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm, dùng để đo hàm lƣợng vi sinh vật có trong thực phẩm.
Nguyên tắc của thử nghiệm này dựa trên phản ứng phát quang ATP của đom đóm. Đom đóm có hai hợp chất hóa học, Luciferin và Luciferase, phản ứng của Luciferin với ATP của côn trùng dƣới tác dụng của enzyme Luciferase, để tạo ra ánh sáng phát quang sinh học [31].
Lƣợng ánh sáng phát quang sinh học đƣợc đo bằng Luminometer và đƣợc biểu thị bằng đơn vị ánh sáng tƣơng đối (RLU). Số lƣợng RLU tỷ lệ thuận với lƣợng ATP. Trong thử nghiệm xác định công hiệu của vắc xin BCG, thử nghiệm phát quang sinh học ATP dùng để kiểm tra khả năng sống của vi khuẩn BCG [32; 33].
Ƣu iểm:
29
Nhƣợc iểm:
- Không phân biệt đƣợc ATP của tế bào vi khuẩn, nấm. - Sai số khi các vi khuẩn kết tụ.
Hình 1.8. Phản ứng của ATP với Luciferin (Nguồn: Riss T.L, Moravec R.A, 2013) [34]. (Nguồn: Riss T.L, Moravec R.A, 2013) [34].
Thử nghiệm o tế bào dòng chảy (Flow Cytometric Assay) kết hợp với máy ếm tế bào
Kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy bắt nguồn từ phát minh của Lou Herzenberg năm 1969, với thiết bị phân loại tế bào dựa vào việc sử dụng ánh sáng huỳnh quang.
Phân tích tế bào theo dòng chảy là một kỹ thuật sinh lý dựa trên laser, đƣợc sử dụng để đếm tế bào, phân loại tế bào, nhận diện dấu sinh học và kỹ thuật protein, bằng cách đƣa tế bào vào một dòng chất lỏng, sau đó cho đi qua một thiết bị dò điện tử. Kỹ thuật này cho phép đồng thời phân tích đa thông số các đặc tính vật lý và hóa học với tốc độ có thể lên đến hàng ngàn hạt mỗi giây. Đếm tế bào đƣợc thực hiện trên hệ thống lõi gồm 3 phần: hệ thống tạo dòng chất lỏng, hệ thống quang học và hệ thống điện tử. Hệ thống tạo dòng chất lỏng cho phép các tế bào từ mẫu xét nghiệm có thể di chuyển thành một
30
dòng đơn lẻ. Các tế bào đƣợc phân tích đƣợc nhuộm bằng thuốc nhuộm huỳnh quang làm chất chỉ thị nhạy cảm để phát hiện và phân biệt phát ánh sáng ở các bƣớc sóng khác nhau. Hệ thống quang học sẽ kích thích và thu nhận các tín hiệu ánh sáng từ các tế bào này thông qua các đèn laser và kính lọc đơn sắc. Các tia laser đƣợc sử dụng trong phép đo tế bào dòng chảy có sẵn ở các bƣớc sóng khác nhau với các mức công suất khác nhau. Tín hiệu quang học này sau đó sẽ đƣợc khuếch đại và chuyển đổi thành tín hiệu số nhờ hệ thống điện tử.
Thử nghiệm đo tế bào dòng chảy là một xét nghiệm rất nhạy, hiệu quả. Phƣơng pháp này sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang làm chất chỉ thị để phát hiện và phân biệt khả năng sống sót của tế bào. Thử nghiệm đo tế bào dòng chảy đã đƣợc phát triển để đo số lƣợng sống sót của M. bovis [35].
Tổng số tế bào trong vắc xin BCG đƣợc đo trực tiếp bằng máy đếm Coulter Z1 hoặc đếm bằng Fluorespheres đếm dòng chảy tế bào trong quá trình xét nghiệm.
Ƣu iểm:
Độ nhạy cao trong việc đếm tế bào vi khuẩn
Có thể đo đƣợc kích thƣớc và hàm lƣợng vi khuẩn với tốc độ 1.000 tế bào/giây
Thời gian đếm tế bào nhanh (4 giờ cho 1 thử nghiệm)
Nhƣợc iểm:
Ngoài tế bào sống sót còn có các tế bào chết dƣơng tính giả ảnh hƣởng đến độ chính xác của kết quả [30; 36].
31
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
2.1.1. Địa iểm nghi n cứu
Phòng sản xuất vắc xin BCG – Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế
2.1.2. Thời gian nghi n cứu
Từ 01/2019 đến 12/2021 2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.2.1. Các mẫu ống 2ml màu nâu có ịnh vị bẻ ƣợc của hãng Schott 2.2.2.Vắc xin BCG ƣợc ông khô trong ống 2ml có ịnh vị bẻ ƣợc ã xác ịnh ƣợc thông số kỹ thuật
2.2.3. Động vật thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng, trọng lƣợng 18- 22g/con - Chuột lang, trọng lƣợng 250- 350g/con
- Tất cả các động vật thí nghiệm đƣợc nuôi tại cơ sở chăn nuôi Suối Dầu của Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế. Động vật thí nghiệm đƣợc giám sát tác nhân gây bệnh, kiểm soát thức ăn, nƣớc uống. Đƣợc nuôi cách ly và đảm bảo chƣa từng đƣợc sử dụng cho mục đích thí nghiệm nào trƣớc đó.
2.2.4. Hóa chất
- L-Asparagine (Sigma - Đức)
- MgSO4.7H2O (Merck - Mỹ)
- K2HPO4 (Merck - Mỹ)
- Ammonium iron (III) (Merck - Mỹ)
- ZnSO4 1,55% (Merck - Mỹ)
- Glycerol (Kanto - Nhật)
- KH2PO4 (Merck - Mỹ)
- Bột khoai tây (Sigma - Đức)
- Malachite oxalate (Merck - Mỹ)
32
2.3. NHÀ XƢỞNG VÀ THIẾT BỊ DỤNG CỤ
2.3.1. Nhà xƣởng
Nhà sản xuất vắc xin BCG, đạt tiêu chuẩn GMP – WHO.
Nhà chăn nuôi động vật thí nghiệm, phòng Kiểm định và đạt tiêu chuẩn GLP - WHO (IVAC).
2.3.2. Thiết bị
- Laminar Regavolt (Anh)
- Lò hấp môi trƣờng Jouan (Pháp)
- Tủ ấm Memmert (Đức)
- Máy đông khô CNME (Trung Quốc)
- Tủ ấm Thermosi (Pháp)
- Tủ lạnh âm GFL (Đức)
- Máy hàn chân không Kumabe (Nhật) - Tủ sấy 2 cửa Memmert (Đức) - Cân phân tích Satorius (Đức)
- Máy khuấy từ IKA (Đức)
- Máy lắc schweiz (Pháp)
- Máy nghiền Oledich (Đan Mạch) - Máy đo độ ẩm tồn dƣ Nakajima (Nhật) - Máy kiểm tra chân không Tesla- Coil (Nhật) - Máy quang phổ kế Thermo Genesys 10UV (Mỹ) - Máy súc rửa Bausch+Strolbel (Đức)
2.3.3. Dụng cụ
- Syringe Cornwall (Thụy Sĩ)
- Ống đong 100 ml (Duran- Đức)
- Tube vặn 20, bình chiết trứng (Pyrex- Đức) - Bình cầu 250ml – 500ml – 1000ml (Duran - Đức) - Pipette nhựa 1ml- 2ml- 10ml (Falcon - Mỹ) - Bình tam giác 250ml, 500ml, 1000ml (Duran - Đức) - Pipette thủy tinh 1ml- 2ml- 10ml (Duran - Đức)
33 2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thiết kế nghi n cứu
Hình 2.1. Sơ ồ nghi n cứu tổng quát
Lựa chọn đƣợc loại ống Lựa chọn loại ống phù hợp với thiết bị Đông khô thử nghiệm 6 lô Xác định thông số kỹ thuật Kiểm tra chất lƣợng vắc xin Thống kê tỷ lệ loại bỏ Sản xuất vắc xin BCG trên ống có định vị bẻ đƣợc Sản xuất thử nghiệm 3 lô Giám sát chất lƣợng 60 lô Đánh giá chất lƣợng dựa trên các tiêu chuẩn xuất xƣởng Chất lƣợng sau sản xuất Xác định loại ống có định vị bẻ đƣợc Nghiên cứu tính ổn định vắc xin BCG Nghiên cứu độ ổn định theo thời gian
thực 1.Độ sống 2. Ổn định nhiệt 3. Độ ẩm tồn dƣ 4. Chân không 5. Cảm quan 6. Tốc độ tạo huyền dịch đồng nhất
34
2.4.1. Xác ịnh loại ống 2ml có ịnh vị bẻ ƣợc phù hợp với thiết bị hiện có của IVAC
2.4.1.1. Lựa chọn và xác định thông số kỹ thuật của loại ống 2ml có định vị bẻ được định vị bẻ được
Ống 2ml có định vị bẻ đƣợc đƣợc cung cấp bởi nhà sản xuất Schott của Đức. Để xác định thông số kỹ thuật cho ống 2 ml có định vị bẻ đƣợc, chúng tôi phối hợp cùng với nhà sản xuất Schott chọn 2 loại ống để thử nghiệm: ống có khứa sẵn tại một vị trí trên cổ ống để dễ bẻ (OPC) và ống có một vòng sơn bằng men sứ tại vị trí cổ ống để làm yếu thủy tinh, dễ bẻ (CBR). Chúng tôi trao đổi nhiều lần và điều chỉnh cho phù hợp với các thiết bị và công nghệ sản xuất vắc xin BCG tại IVAC.
Các mẫu ống 2ml có định vị bẻ đƣợc đƣợc đánh giá qua 6 bƣớc sau:
Hình 2.2. Các bƣớc l a chọn ống 2 ml có ịnh vị bẻ ƣợc hãng Schott
Đánh giá cảm quan
Tỷ lệ bể vỡ
Kiểm tra các thông số kỹ thuật cơ bản Tỷ lệ loại bỏ trong quá trình sử dụng thử trên thiết bị Tỷ lệ bẻ thành công Kiểm tra chất lƣợng nguyên liệu đầu
Ống 2ml có định vị
35
Bảng 2. 1. Ti u chuẩn ánh giá các thông số kỹ thuật của ống 2 ml có ịnh vị bẻ ƣợc của hãng Schott
STT Tiêu chí đánh giá Tiêu chuẩn cơ sở
1 Đánh giá cảm quan
Màu sắc trên cùng 1 ống và giữa các ống phải nhƣ nhau. Hình dạng các ống đồng đều khi quan sát bằng mắt
2 Tỷ lệ bể vỡ do vận
chuyển 0%
3 Kiểm tra các thông số kỹ thuật cơ bản
Theo bản vẽ thiết kế kỹ thuật của các mẫu ống tiêm và đo thực tế bằng thƣớc kỹ thuật các thông số cơ bản gồm: h1, h4, d1, d2, d3, d7, so sánh với tiêu chuẩn kỹ thuật nguyên liệu đầu(*)
4
Tính tỷ lệ loại bỏ ống trong quá trình sử dụng thử trên thiết bị (giai đoạn súc rửa, phân ống, hàn ống).
≤ 7%
5 Tỷ lệ bẻ thành công 100% các ống đều bẻ đƣợc khi bẻ thử (**) 6 Kiểm tra chất lƣợng
nguyên liệu đầu
Đạt tiêu chuẩn chất lƣợng nguyên liệu đầu cho ống tiêm sản xuất vắc xin BCG
(*): Ti u chuẩn kỹ thuật nguy n liệu ầu
h1: tổng chiều cao của ống tiêm. h4: chiều cao bầu chứa.
d1: đƣờng kính thân.
d2: đƣờng kính cổ ống (vị trí bẻ gãy). d3: đƣờng kính bầu trên.
36
Hình 2.3. Bản vẽ thiết kế kỹ thuật ống 2 ml có ịnh vị bẻ ƣợc
(**): Phƣơng pháp đánh giá tỷ lệ bẻ thành công: bẻ thử, số lƣợng mẫu 500 ống, 10 ngƣời bẻ, phân làm 2 nhóm: 5 nam và 5 nữ, mỗi ngƣời bẻ 50 ống.
Đánh giá tỷ lệ bẻ thành công ống 2 ml có định vị bẻ đƣợc.
2.4.1.2. Đông khô thử nghiệm vắc xin BCG trên ống 2ml đã xác định thông số kỹ thuật thông số kỹ thuật
Ống 2ml có định vị bẻ đƣợc đã xác định đƣợc thông số kỹ thuật phù hợp với trang thiết bị hiện có tại IVAC: máy súc rửa Bausch+Strolbel, syringe Cornwall, máy hàn chân không Kumabe ES-1500. Chúng tôi tiến hành đông khô thử nghiệm 6 lô vắc xin BCG trên ống 2ml có định vị bẻ đƣợc. Sử dụng cùng một lô vắc xin BCG bán thành phẩm, tách riêng 1 phần để phân liều và đông khô trên ống 2ml có định vị bẻ đƣợc (gọi là lô thí nghiệm – TN). Mỗi lô thí nghiệm (TN) đông khô 400 ống. Phần vắc xin BCG bán thành phẩm còn lại đƣợc thực hiện theo quy trình chuẩn sản xuất vắc xin BCG của IVAC (gọi là lô đối chứng - ĐC). Mỗi lô đối chứng (ĐC) khoảng 7000 ống.
Đông khô thử nghiệm 6 lô thí nghiệm liên tiếp (TN1, TN2, TN3, TN4, TN5 và TN6) và 6 lô đối chứng tƣơng ứng (ĐC1, ĐC2, ĐC3, ĐC4 và ĐC6). Các lô thí nghiệm và lô đối chứng đƣợc phân liều, đông khô và hàn ống trong cùng điều kiện.
37
Sơ đồ qui trình sản xuất và kiểm định vắc xin BCG
Hình 2.4. Sơ ồ quy trình sản xuất vắc xin BCG (Nguồn: Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế, 2020) [37].
Chủng gốc 1173 P2 Lot C/WS Cảm quan, vô trùng -Vô trùng -An toàn đặc hiệu -Vô trùng - Mật độ quang - Độ phân tán - Độ sống tƣơi - Vô trùng tƣơi Kiểm tra -Vô trùng - Nhận dạng
-An toàn không đặc hiệu -Mật độ quang -Độ phân tán -Cảm quan -Độ ẩm tồn dƣ -Tốc độ tạo huyền dịch đồng nhất -Chân không -Độ sống -Ổn định nhiệt Kiểm định
Giai đoạn nuôi cấy, pha chế vắc xin tƣơi
Giai đoạn đông khô, hàn ống chân không
Giai đoạn đóng gói thành phẩm
Nhân chủng
Cấy chuyền sản xuất
Gặt, nghiền sinh khối
Pha chế vắc xin tƣơi
Phân ống 2ml có định vị bẻ đƣợc và không bẻ đƣợc Đông khô Hàn ống chân không Đóng gói Biệt trữ
38
Qui trình sản xuất vắc xin BCG
Nhân chủng (S1): Đƣa BCG từ ống chủng sản xuất 1173 P2 lot C/WS vào môi trƣờng Sauton, theo dõi 21 ngày ở nhiệt độ 37 ±1o
C. Quan sát màng BCG khô, có màu vàng nhạt, xếp đều đặn trên bề mặt bình Sauton. Tiến hành cấy chuyền sản xuất.
Cấy chuyền sản xuất (S2): Chuyền màng BCG từ bình S1 sang môi trƣờng Sauton. Tiêu chuẩn đánh giá trƣớc khi gặt: màng BCG màu vàng tƣơi, mọc dày, xếp đều đặn trên bề mặt bình Sauton.
Gặt, pha chế vắc xin tươi: màng BCG (S2 ) sau 6-7 ngày trên môi trƣờng Sauton đạt tiêu chuẩn về cảm quan (màu sắc, độ leo), gặt thu sinh khối bằng bộ lọc Birkhaug. Đƣa sinh khối vào nghiền và pha với Glutamate Natri 1,5% để có đậm độ 50mg/ml.
Pha bán thành phẩm: Vắc xin BCG đƣợc pha với tá chất Glutamat Natri 1,5% để có đậm độ 2,5mg/ml
Phân ống: Quá trình phân ống đƣợc thực hiện theo qui trình chuẩn sản
xuất vắc xin BCG của IVAC, bằng bơm tiêm phân liều (Syringe Cornwall) đã đƣợc chuẩn định. Trong suốt quá trình phân ống vắc xin BCG phải đƣợc đặt lên trên máy khuấy từ và giữ ở nhiệt độ 2-8oC. Sau khi phân ống, dùng máy lắc đều để vắc xin BCG không bị lắng trƣớc khi làm đông.
Đông khô: Vắc xin BCG đƣợc đƣa vào đông khô trên máy đông khô CNME với 2 giai đoạn làm đông và làm khô. Giai đoạn làm đông đƣợc thể hiện ở 2 cấp:
o Làm đông cấp I ở nhiệt độ -30oC trong 4 -6 giờ o Làm đông cấp II ở -42oC, thời gian làm đông ≥ 8 giờ
Tổng thời gian của giai đoạn làm đông không đƣợc ít hơn 12 giờ và nhiệt độ sau cùng vắc xin BCG kết thúc giai đoạn làm đông là -38oC ± 2o
C. -Vắc xin BCG đƣợc làm khô trong điều kiện chân không và cũng đƣợc thực hiện 2 cấp:
oLàm khô cấp I (giai đoạn tách nƣớc tự do): từ 4 - 5 giờ trong điều kiện chân không ≤ 20 Pa và nhiệt độ giàn ngƣng tụ ≤ -50oC. Nhiệt độ vắc xin