CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.2.1. Sản xuất thử nghiệm vắc xin BCG trong ống 2ml có định vị bẻ
- Sau khi đã xác định và chọn lựa đƣợc loại ống 2ml có định vị bẻ đƣợc phù hợp, tiến hành sản xuất 3 lô vắc xin BCG, 14000 ống/lô (tƣơng đƣơng cỡ lô sản xuất thƣờng qui) theo qui trình sản xuất nhƣ mô tả ở sơ đồ 2.3
40 - Các bƣớc thực hiện:
Kiểm tra chất lƣợng của 3 lô vắc xin BCG đông khô trên ống 2ml có định vị bẻ đƣợc theo các chỉ tiêu của TCCL dùng cho xuất xƣởng vắc xin (WHO.TRS 979, 2013 và DĐVN V, 2017).
- Đánh giá kết quả:
Đánh giá kết quả thu đƣợc theo tiêu chuẩn xuất xƣởng vắc xin BCG (WHO.TRS 979, 2013 và DĐVN V, 2017).
Bảng 2.2. Ti u chuẩn xuất xƣởng của vắc xin BCG
STT Chỉ ti u Phƣơng pháp Ti u chuẩn
chấp nhận Tài liệu tham chiếu
01 Độ sống sau đông
khô Nuôi cấy 1 - 6 x 106 đvs/mg DĐVN V, 2017
02 Tính ổn định nhiệt Nuôi cấy ≥ 20% TRS 979, 2013
03 Dạng vật lý Quan sát bằng
mắt
Dạng bột trắng khô,
bong, không teo. DĐVN V, 2017
04 Tốc độ tạo huyền dịch đồng nhất Quan sát bằng mắt Dễ tan, nhanh chóng tạo thành huyền dịch đồng nhất sau 1 phút. DĐVN V, 2017
05 Mật độ quang Đo quang
(λ = 490nm) ≤ 0,5 DĐVN V, 2017
06 Độ phân tán Đo quang ≥ 0,9 DĐVN V, 2017
07 Chân không Máy Tesla -
Coil
100% ống đạt chân
không DĐVN V, 2017
08 Độ ẩm tồn dƣ Abderhalden
(đo máy) ≤ 3% DĐVN V, 2017
09 An toàn đặc hiệu Thử trên
chuột lang
Ít nhất 2/3 số chuột khoẻ mạnh, lên cân. Toàn bộ chuột lang thí nghiệm không có biểu hiện lao tiến triển sau 6 tuần theo dõi.
TRS 979, 2013 DĐVN V, 2017
41
10 An toàn chung Thử trên
chuột nhắt
Toàn bộ chuột sống khỏe mạnh, lên cân và không có biểu hiện bệnh lý sau 7 ngày. TRS 979, 2013 DĐVN V, 2017 11 Phản ứng da Thử trên chuột lang Kích thƣớc của phản ứng tại chỗ phải tƣơng đƣơng với vắc xin mẫu chuẩn có cùng độ pha.
TRS 979, 2013 DĐVN V, 2017
12 Tính vô khuẩn Cấy trực tiếp
Không có sự phát triển của vi sinh vật sau 14 ngày theo dõi.
TRS 979, 2013 DĐVN V, 2017
13 Nhận dạng
Cấy trên môi trƣờng Lowenstein - Jensen và nhuộm Ziehl – Neelsen Trên môi trƣờng LJ, khuẩn lạc khô, xù xì màu trắng hay vàng ngà.
Nhuộm Ziehl- Nelsen trực khuẩn hình que, mảnh, bắt màu đỏ trên nền xanh.
TRS 979, 2013 DĐVN V, 2017
2.4.2.2. Giám sát tính ổn định chất lượng của vắc xin BCG sản xuất trên ống 2ml có định vị bẻ được
- Đánh giá chất lƣợng của tất cả các lô vắc xin BCG sản xuất trên ống 2ml có định vị bẻ đƣợc từ tháng 2/2020 đến tháng 06/2021 theo tiêu chuẩn xuất xƣởng so sánh với chất lƣợng của 60 lô sản xuất trên ống dùng vật liệu tạo vết khứa đƣợc sản xuất từ 10/2018 đến 01/2020 về các thông số: độ sống, độ phân tán, độ ẩm tồn dƣ, độ chân không, ổn định nhiệt.
Thống kê kết quả các thông số của 60 lô vắc xin BCG đƣợc sản xuất trong ống có định vị bẻ đƣợc và 60 lô dùng vật liệu tạo vết khứa. Phân tích xu hƣớng các thông số và sử dụng phƣơng pháp kiểm định T-test trong phần mềm SPSS để đánh giá sự khác biệt giữa 2 loại ống.
42
2.4.3. Nghi n cứu tính ổn ịnh của vắc xin BCG tr n ống 2ml có ịnh vị bẻ ƣợc
- Đƣợc thực hiện trên 3 lô vắc xin BCG thành phẩm sản xuất thử nghiệm.
- Tính ổn định đƣợc thực hiện trên các mẫu đặt ở 2-8oC và 37o
C trong 6 tháng, 12 tháng, 18 tháng. Tại các thời điểm kể trên vắc xin đƣợc kiểm tra các chỉ tiêu chỉ điểm theo tiêu chuẩn xuất xƣởng gồm:
oTính ổn định về độ sống oTính ổn định về ổn định nhiệt oTính ổn định về độ ẩm tồn dƣ oTính ổn định về độ chân không oTính ổn định về dạng vật lý (cảm quan) oTính ổn định về tốc độ tạo huyền dịch đồng nhất
Ghi chú: Tính ổn định của vắc xin bảo quản ở 2-8oC sau khi tiếp tục được theo dõi cho đến 36 tháng nhưng không thuộc phạm vi của nghiên cứu này)
2.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP KIỂM ĐỊNH CHẤT LƢỢNG
2.5.1. Nguy n tắc lấy mẫu kiểm ịnh
-Mẫu đƣợc lấy ngẫu nhiên, đủ số lƣợng và đƣợc bảo quản lƣu trữ đúng qui định đảm bảo tính toàn vẹn của mẫu nghiên cứu.
- Mỗi giai đoạn phải lấy số mẫu phù hợp để thực hiện kiểm định
- Công thức lấy mẫu không ít hơn 0.4 N (N số lƣợng mẫu của lô vắc xin) - Mẫu phải đảm bảo tính đại diện cho cả lô thành phẩm.
Đánh giá chỉ tiêu chân không phải thực hiện trên toàn bộ số ống của lô vắc xin sản xuất.
2.5.2. Phƣơng pháp kiểm ịnh
Đƣợc thực hiện theo khuyến cáo của WHO, hƣớng dẫn WHO/TRS 979, 2013 và Dƣợc điển Việt Nam V, 2017.
43
2.5.2.1. Kiểm định chỉ tiêu độ sống
- Cách tiến hành
Hoàn nguyên 10 ống vắc xin BCG (0,5mg/ống) bằng 5ml dung dịch Sauton ¼ vô trùng, đây là hỗn dịch cơ bản (1mg/1ml).
- Pha vắc xin BCG với dung dịch Sauton ¼ về nồng độ: 1/100; 1/10.000; 1/20.000; 1/40.000, 1/80.000, 1/160.000.
- Kiểm tra độ sống vắc xin BCG tƣơi pha ba độ pha loãng 1/40.000, 1/80.000, 1/160.000
Kiểm tra độ sống vắc xin BCG sau đông khô pha ba độ pha loãng 1/20.000, 1/40.000, 1/80.000
Kiểm tra ổn định nhiệt vắc xin BCG ở 4oC/28 ngày dùng ba độ pha loãng 1/20.000, 1/40.000, 1/80.000
Kiểm tra ổn định nhiệt vắc xin BCG ở 37oC/28 ngày dùng ba độ pha loãng 1/10.000, 1/20.000, 1/40.000.
Ở mỗi thử nghiệm kiểm tra độ sống vắc xin BCG đều đƣợc thực hiện trên 20 ống môi trƣờng LJ ở ba độ pha loãng. Hai độ pha loãng đầu, mỗi độ pha cấy trên 5 ống môi trƣờng LJ, độ pha loãng thứ 3 cấy trên 10 ống môi trƣờng LJ. Mỗi ống cấy 0,1ml dung dịch BCG pha loãng ở mỗi đậm độ, láng đều cho đến khi bề mặt môi trƣờng khô.
Ủ vào tủ ấm 37oC sau 28 ngày, đọc kết quả.
Đếm số lƣợng khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng LJ. Số đơn vị sống đƣợc tính bằng chƣơng trình WHO Program BCG – Biopharma do WHO cung cấp.
- Tiêu chuẩn đánh giá
Độ sống sau đông khô: 1 - 6 x 106
đvs/mg.
2.5.2.2. Kiểm tra ổn định nhiệt
- Cách tiến hành
Từ kết quả kiểm tra độ sống ở 4oC và 37oC/28 ngày, tỷ lệ ổn định nhiệt của vắc xin BCG đƣợc tính theo công thức:
44
Tỷ lệ % ổn định nhiệt =
Số đơn vị sống/mg vắc xin BCG ủ 37oC/28 ngày
x 100 Số đơn vị sống/mg vắc xin BCG ủ 4oC/28 ngày
- Tiêu chuẩn đánh giá Tính ổn định nhiệt: ≥ 20%
2.5.2.3. Kiểm tra dạng vật lý
- Cách tiến hành
Kiểm tra dạng vật lý của vắc xin BCG bằng mắt thƣờng. - Tiêu chuẩn đánh giá
Vắc xin BCG có dạng bột trắng, bong, không teo, không chứa tạp chất.
2.5.2.4. Kiểm tra tốc độ tạo huyền dịch
- Cách tiến hành
Hoà tan vắc xin BCG vào dung dịch nƣớc muối sinh lý đẳng trƣơng. - Tiêu chuẩn đánh giá
Vắc xin BCG dễ tan và tạo thành huyền dịch đồng nhất không quá 1 phút.
2.5.2.5. Kiểm tra mật độ quang
- Cách tiến hành
Hoàn nguyên vắc xin BCG (1mg/ml) đo bằng máy quang phổ kế ở bƣớc sóng 490nm.
- Tiêu chuẩn đánh giá Mật độ quang OD 0,5
2.5.2.6. Kiểm tra độ phân tán
- Cách tiến hành
Hoàn nguyên vắc xin BCG (1mg/ml) đo bằng máy quang phổ kế ở bƣớc sóng 630nm và 434nm.
45 Độ phân tán =lg OD1- lg OD2
0.1618
OD1: mật độ quang học của huyền dịch vắc xin BCG đo đƣợc ở bƣớc sóng 1=434nm.
OD2: mật độ quang học của huyền dịch vắc xin BCG đo đƣợc ở bƣớc sóng 2=630nm, lg2 − lg1 = 0,1618.
- Tiêu chuẩn đánh giá
Độ phân tán của vắc xin BCG 0,9
2.5.2.7. Kiểm tra chân không
- Cách tiến hành
Chân không của các ống vắc xin BCG đƣợc kiểm tra bằng máy Tesla – Coil. Kiểm tra theo nguyên tắc ria tia phát điện trên các đầu của ống vắc xin.
- Tiêu chuẩn đánh giá
Vắc xin BCG đạt chân không khi các ống phát ra ánh sáng màu tím đến trắng xanh.
2.5.2.8. Kiểm tra độ ẩm tồn dư
- Cách tiến hành
Độ ẩm tồn dƣ của vắc xin BCG đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp Abderhalden, dùng bình phân tách Nakajima để chứa bột vắc xin BCG.
- Tiêu chuẩn đánh giá
Độ ẩm tồn dƣ của vắc xin BCG: 3%.
2.5.2.9. Kiểm tra an toàn đặc hiệu
- Cách tiến hành
Tiến hành trên chuột lang cùng giống, trọng lƣợng 250 – 400g/con, và có phản ứng Tuberculin âm tính. Sử dụng 6 chuột lang cho mỗi lô vắc xin BCG, liều tiêm 5mg/0,5ml/con, đƣờng tiêm dƣới da.
46
Chuột đƣợc chăm sóc và nuôi dƣỡng trong khu vực riêng biệt theo đúng chế độ, theo dõi chuột hàng tuần. Sau 6 tuần, kiểm tra trọng lƣợng từng chuột lang và thử phản ứng Tuberculin. Đọc kết quả sau 24 giờ và mổ chuột kiểm tra phủ tạng để tìm các tổn thƣơng đặc hiệu.
- Tiêu chuẩn đánh giá
Lô vắc xin BCG đƣợc coi là an toàn nếu không có chuột lang nào có biểu hiện của bệnh lao tiến triển và có ít nhất 2/3 số chuột còn sống khoẻ mạnh lên cân cho đến khi hết thời gian theo dõi.
2.5.2.10. Kiểm tra an toàn không đặc hiệu (an toàn chung)
- Cách tiến hành
Sử dụng 5 chuột nhắt trắng trọng lƣợng 17 – 22g/con cho mỗi lô vắc xin BCG, tiêm dƣới da 1mg/1ml/con. Theo dõi 7 ngày và cân trọng lƣợng cuối cùng từng con.
- Tiêu chuẩn đánh giá
Lô vắc xin BCG đạt an toàn không đặc hiệu khi toàn bộ số chuột nhắt đƣợc tiêm sống khoẻ mạnh, lên cân và không có biểu hiện bệnh lý sau 7 ngày theo dõi.
2.5.2.11. Kiểm tra phản ứng da
Là thử nghiệm phản ứng tại chỗ trên chuột lang của mỗi loạt vắc xin khi tiêm trong da, có so sánh với phản ứng BCG mẫu chuẩn ở cùng độ pha theo phƣơng pháp Jensen test.
- Cách tiến hành
4 chuột lang 250 – 400g/con
Vắc xin BCG mẫu thử 1mg/ml pha loãng 1/1 1mg/ml. Vắc xin BCG mẫu thử 1mg/ml pha loãng 1/10 0,1mg/ml. Vắc xin BCG mẫu thử 1mg/ml pha loãng 1/100 0,01mg/ml.
47
Ngày 27 thử Tuberculin 5TU/0,1ml/con.
Ngày 28 đo đƣờng kính vắc xin mẫu thử, Tuberculin. Đo đƣờng kính phản ứng Tuberculin.
- Tiêu chuẩn đánh giá Đƣờng kính > 5 mm.
2.5.2.12. Kiểm tra vô khuẩn
- Cách tiến hành
Vắc xin BCG đƣợc hoàn nguyên bằng nƣớc muối sinh lý vô khuẩn, cấy trực tiếp vào môi trƣờng Thioglycolate và Triptic Soy Broth (TSB). Ủ mẫu ở nhiệt độ 20 - 25o
C và 30 - 35oC. Theo dõi hàng ngày và đọc kết quả sau 14 ngày. - Tiêu chuẩn đánh giá
Không có sự phát triển của vi sinh vật sau 14 ngày theo dõi.
2.5.2.13. Kiểm tra nhận dạng
- Cách tiến hành
Cấy trực tiếp vi khuẩn BCG trên môi trƣờng Lowenstein-Jensen, ủ nhiệt độ 37oC/28 ngày.
Nhuộm vi khuẩn bằng phƣơng pháp Zeihl-Neelsen. - Tiêu chuẩn đánh giá
Khuẩn lạc khô, xù xì màu trắng hoặc ngà vàng trên môi trƣờng Lowenstein-Jensen.
Trực khuẩn hình que, mảnh, bắt màu đỏ trên nền xanh khi nhuộm Zeihl-Neelsen.
2.5.3. Phƣơng pháp xử lý thống k
So sánh các kết quả kiểm định và tỷ lệ loại bỏ trong suốt quá trình sản xuất của vắc xin BCG trên ống 2 ml có định vị bẻ đƣợc đã xác định thông số kỹ thuật với vắc xin sản xuất trên ống dùng vật liệu tạo vết khứa để bẻ hiện nay.
48
Xử lý số liệu theo phƣơng pháp thống kê bằng phân tích Paired- Samples T- test trên phần mềm SPSS 16.0 để xử lý kết quả so sánh các chỉ tiêu chất lƣợng của vắc xin BCG sản xuất trên ống 2 ml có định vị bẻ đƣợc với vắc xin BCG sản xuất thƣờng qui trên ống 2 ml đang sử dụng vật liệu khứa hiện nay.
49
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH LOẠI ỐNG CÓ ĐỊNH VỊ BẺ ĐƢỢC
3.1.1. Kết quả l a chọn loại ống 2ml có ịnh vị bẻ ƣợc phù hợp
3.1.1.1. Kết quả đánh giá các loại ống 2 ml có định vị bẻ được do nhà cung cấp giới thiệu
Bảng 3.1. Kết quả ánh giá 5 loại ống 2 ml có ịnh vị bẻ ƣợc
Chỉ tiêu kiểm tra Các loại mẫu ống đƣợc giới thiệu (n = 2000 ống)
1 2 3 4 5
Loại ống thủy tinh OPC OPC CBR CBR CBR
1. Cảm quan (*) Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt 2. Tỷ lệ bể vỡ giai đoạn vận chuyển 18,6% 0% 0% 0% 0% 3. Đƣờng kính bầu trên d3 (mm) KTH 7,5 / / / Kích thƣớc về độ dày vòng sơn cổ (mm) KTH KTH 1,2 1,1 0,9± 0,1 4. Tỷ lệ loại bỏ khi dùng thử trên thiết bị hiện có KTH KTH 26,54% 18,32% 4,5% 5. Tỷ lệ bẻ thành công sau khi hàn ống Lực bẻ KTH KTH KTH KTH 100% 93,30N 6. Chất lƣợng nguyên liệu đầu (ống 2ml) KTH KTH KTH KTH Đạt
(*): Kiểm tra các chỉ tiêu: hình dạng, màu sắc, độ trong KTH: Không thực hiện
50 Bảng 3.1 cho thấy:
- Mẫu số 1: Ống có cứa sẵn (ống OPC) không đáp ứng đƣợc yêu cầu kỹ thuật, ngay trong quá trình vận chuyển đã bị gãy nhiều tại vị trí cứa sẵn (18,6%).
- Mẫu số 2: Ống có cứa sẵn (ống OPC) không đạt tiêu chuẩn kỹ thuật do đƣờng kính bầu trên (d3 = 7,5 mm) lớn hơn so với tiêu chuẩn là 7,0 ± 0,4 mm.
- Mẫu số 3: Ống có vòng sơn quanh cổ (ống CBR) đạt các yêu cầu về cảm quan, không gãy vỡ do vận chuyển, các thông số kỹ thuật phù hợp với các thiết bị hiện có. Tuy nhiên tỷ lệ loại bỏ của loại ống này trong quá trình thử nghiệm là 26,54%, tỷ lệ này quá cao so với tiêu chuẩn là ≤7%, không thể sử dụng đƣợc.
- Mẫu số 4: Ống có vòng sơn quanh cổ (ống CBR) đã đƣợc điều chỉnh lực bẻ so với mẫu số 3. Tỷ lệ loại bỏ chân không qua các thử nghiệm là 18,32%, tỷ lệ này còn cao so với tiêu chuẩn là ≤ 7%.
- Mẫu số 5: Ống có vòng sơn quanh cổ (ống CBR) mẫu số 5, đƣợc điều chỉnh lực bẻ bằng cách thay đổi kích thƣớc độ dày vòng sơn cổ là 0,9 ± 0,1mm. Bƣớc đầu xác định ống có định vị bẻ đƣợc phù hợp với các chỉ tiêu kiểm tra. Chúng tôi tiến hành đánh giá chất lƣợng theo tiêu chuẩn ở các bƣớc tiếp theo.
3.1.1.2. Kết quả xác định thông số kỹ thuật của loại ống 2 ml có định vị bẻ được vị bẻ được
Sau khi đánh giá sơ bộ 5 loại ống do nhà cung cấp giới thiệu, bƣớc đầu cho thấy mẫu ống số 5 đạt các tiêu chí do IVAC yêu cầu do đó chúng tôi đặt hàng mẫu ống số 5 để đo đạc các thông số kỹ thuật, đánh giá chất lƣợng của loại ống này và đặt tên là ống 2ml có định vị bẻ đƣợc.
51
Bảng 3.2. So sánh các thông số kỹ thuật của 2 loại ống 2ml có ịnh vị bẻ ƣợc và ống 2ml ang sử dụng vật liệu khứa hiện nay (n = 20)
Tiêu chí kiểm tra
Loại ống Tiêu chuẩn Không có định vị bẻ đƣợc Có định vị bẻ đƣợc Tổng chiều cao (h1) 92,5 mm 92,2 mm 92.5 ± 1,0 mm Chiều cao bầu chứa (h4) 39,8 – 39,9
mm 39,0 – 39,1 mm 40,0 ± 1,0 mm Đƣờng kính thân (d1) 11,1 mm 11,1 mm 11,0 ± 0,25 mm Đƣờng kính cổ (d2) 5,5 – 5,6 mm 5,6 mm 5,5 ± 0,5 mm Đƣờng kính bầu trên (d3) 7,0 – 7,1mm 7,0 – 7,1mm 7,0 ± 0,4 mm Đƣờng kính miệng (d7) 5,7 – 5,8mm 5,5 – 5,8 mm 5,5 ± 0,3 mm Độ dày vòng sơn cổ / 0,9 ± 0,1 mm 0,9 ± 0,2 mm Với các tiêu chuẩn kỹ thuật trên (bảng 3.2) cho ta thấy kết quả các thông số gồm: tổng chiều cao, chiều cao bầu chứa, đƣờng kính thân, đƣờng