PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.5. Tối ưu điều kiện lên men xốp chủng nấm đột biến chọn lọc cho sinh tổng h ợp đa enzyme (glucoamylase, α-amylase, cellulase)
Trong quá trình sản xuất enzyme, bên cạnh cải tiến chủng thì việc tối ưu môi trường lên men luôn được tiến hành đểtăng sản lượng của sản phẩm mong muốn. Vi sinh vật cần được cung cấp đầy đủ các dưỡng chất cho sự sinh sản, phát triển và hoạt động. Các dưỡng chất này gồm các nguồn cung cấp carbon, nitơ, vitamin, khoáng cũng như các nguyên tốvi lượng khác và môi trường lên men cần được duy trì thường xuyên ởđiều kiện tối ưu. Các thông số như nhiệt độ, áp suất, pH, lượng oxy phải được thường xuyên theo dõi và khống chếở giá trị tối ưu.
4.1.5.1. Cơ chất
Cơ chất sử dụng trong lên men xốp thường không hòa tan trong nước. Thực tế, nước sẽđược hấp thụ vào các hạt cơ chất, sau đó vi sinh vật có thể sử dụng cho các hoạt động phát triển và trao đổi chất. Cơ chất sử dụng trong lên men xốp có thểđược chia thành 3 nhóm, cơ chất giàu tinh bột (gạo, sắn, cám mì, cám gạo, bột ngô, bã khoai lang, bột chuối…); cơ chất giàu xơ (rơm lúa mì, rơm rạ, cám lúa mì, gỗ…) và nhóm cơ chất có đường hòa tan (bã nho, bã đậu, củ cải đường, chất thải dứa, bã cà phê…) (Manpreet & cs., 2005).
Trong nghiên cứu của đề tài, lựa chọn các loại cơ chất khác nhau là cám mì, cám gạo, vỏ trấu và mùn cưa để tiến hành lên men xốp chủng Aspergillus niger
GA15 để lựa chọn cơ chất thích hợp nhất cho sản sinh đa enzyme) được sử dụng trong lên men để xác định ảnh hưởng của nó trong việc sản xuất đa enzyme α- glucoamylase, α-amylase và cellulase.
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của loại cơ chất đến khảnăng sản xuất enzyme của chủng đột biến Aspergillus niger GA15
Cơ chất Hoạt tính enzyme (U/g), n=3 Glucoamylase (Mean ± SE) α-amylase (Mean ± SE) Celullase (Mean ± SE) Cám gạo 27,01b ± 1,10 38,77b ± 1,58 12,20b ± 0,88 Cám mì 34,78a ± 1,54 49,88a ± 2,19 16,74a ± 0,26 Mùn cưa 17,47c ± 0,83 25,15c ± 1,19 9,81b ± 0,79 Trấu 13,34c ± 0,60 19,25c ± 0,86 6,34c ± 0,15
Kết quả cho thấy, ở các môi trường cơ chất khác nhau, sự sản sinh glucoamylase, amylase và cellulase của chủng Aspergillus niger GA15 là khác nhau rõ rệt (P<0,05) (Bảng 4.3, Hình 4.4).
Sự sản sinh enzyme cao nhất được quan sát trên môi trường có cơ chất là cám mì, với hoạt tính của glucoamylase, α-amylase và cellulase lần lượt là 34,78; 49,88 và 16,74 (U/g), hoạt tính thấp với cơ chất là trấu và mùn cưa. So với môi trường có cơ chất cám gạo (đối chứng) thì hoạt tính của các enzyme này cũng cao hơn hẳn. Do đó, cám mì được lựa chọn sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 4.4. Ảnh hưởng của loại cơ chất đến sinh tổng hợp enzyme của chủng đột biến Aspergillus niger GA15
Sự khác nhau trong sản xuất enzyme khi sử dụng các cơ chất khác nhau trong lên men xốp phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm bản chất cấu trúc của cơ chất, độ xốp, và ảnh hưởng của nó đến sự xâm nhập của vi sinh vật. Vi sinh vật thường có xu hướng lựa chọn những cơ chất có độ xốp cao hoặc vật liệu giòn (dễ phân hủy) đểlàm môi trường dinh dưỡng vì nó dễdàng sinh trưởng vào bên trong các hạt cơ chất, từ đó ảnh hưởng đến hiệu suất sản sinh enzyme của vi sinh vật. Chính vì vậy năng suất enzyme bịảnh hưởng nhiều bởi kích thước của các hạt cơ chất, những cơ chất mà có kích thước hạt nhỏ vừa phải, hợp lý, sẽ làm tăng hiệu suất sản sinh enzyme bằng cách tăng diện tích tiếp xúc bề mặt cho vi sinh vật, việc vận chuyển oxi và nhiệt được thuân lợi (Bedan & cs., 2014; Kumari & cs., 2012). Theo Vu & cs. (2011) và Vu & cs.(2010) cũng đã chỉ ra rằng, cám mì là nguồn cơ chất thích hợp nhất trong lên men xốp để sản xuất cellulase và enzyme thủy phân tinh bột sống bởi các chủng đột biến chọn lọc.
4.1.5.2. Độ ẩm
Trong quá trình lên men, điều quan trọng là phải cung cấp một hàm lượng nước tối ưu và kiểm soát hoạt độnước của cơ chất, vì sự có mặt của nước ở nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn sẽ ảnh hưởng xấu đến hoạt động của vi sinh vật. Hơn nữa, nước có tác động lớn đến các tính chất lý hoá của chất rắn và điều này ảnh hưởng đến tổng sản lượng (năng suất) của quá trình lên men (Pandey & cs., 1999).
Cám mì được bổsung nước đểcó độẩm khác nhau. Nghiên cứu nhằm chọn độẩm tối ưu cho sản xuất đa enzyme.
Bảng 4.4. Hoạt tính enzyme của chủng đột biến Aspergillus niger GA15
ởcác độẩm cơ chất khác nhau Độẩm (%, w/v) Hoạt tính enzyme (U/g), n=3 Glucoamylase (Mean ± SE) α-amylase (Mean ± SE) Celullase (Mean ± SE) 20 16,84c ± 0,86 21,82c ± 1,11 10,66c ± 1,30 30 33,99a ± 0,61 45,53a ± 0,53 16,59b ± 1,99 40 34,71a ± 1,56 46,42a ± 1,20 17,73b ± 0,37 50 39,16a ± 0,79 52,64a ± 0,26 22,75a ± 0,69 60 22,86b ± 1,88 30,04b ± 2,22 10,16c ± 0,94 70 15,51c ± 1,17 19,95c ± 1,61 7,02c ± 0,87
Ghi chú: Các chữ cái trong cùng một cột khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p<0,05)
Kết quả cho thấy, hoạt tính của enzyme glucoamylase và α-amylase của chủng Aspergillus nigerGA15 đạt cao ởđộẩm 30, 40 và 50%, thấp ởđộẩm 20 và 70%. Hoạt tính của cellulase đạt cao nhất ở 50% với 22,75 U/g, thấp ởcơ chất có độ ẩm 20, 60 và 70%. Vì vậy, lựa chọn 50% là độ ẩm thích hợp cho sự sản xuất của cả 3 loại glucoamylase, α-amylase và cellulase của chủng nấm sợi Aspergillus niger GA15 với hoạt tính lần lượt là 39,16; 52,64 và 22,74 (U/g) (Bảng 4.4, Hình 4.5). Tỷ lệđộẩm 50% này được sử dụng tiếp cho các thí nghiệm tiếp theo.
Trong lên men rắn, độẩm có vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp và tiết enzyme. Mức độ thủy phân cơ chất có vai trò quan trọng trong sựsinh trưởng của nấm sợi và sau đó là sự sản sinh enzyme. Nước làm cho cơ chất trương lên và tăng khả năng sử dụng cơ chất của vi sinh vật. Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm giảm độ rỗng bề mặt của môi trường, giảm sựlưu thông oxy trong môi trường từđó làm giảm khả năng sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Ngược lại, ở độ ẩm thấp sẽ làm giảm mức độ hòa tan các chất dinh dưỡng của cơ chất từđó sẽ kìm hãm sựsinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme của nấm sợi (Bedan & cs., 2014)
Hình 4.5. Ảnh hưởng của độẩm cơ chất đến sinh tổng hợp glucoamylase
α-amylase và cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15
Cơ chất sử dụng trong lên men xốp không tan trong nước, do đó nước được hấp thụ trên bề mặt của các hạt cơ chất cho sự sử dụng của các vi sinh vật để sinh trưởng và từđó sản sinh ra enzyme. Theo Vu & cs. (2010) cũng cho biết tỷ lệđộ ẩm tối ưu cho việc sản sinh enzyme thủy phân tinh bột sống sử dụng chủng đột biến Aspergillus niger XN15 là 50% với hoạt tính là 62,52U/g.
4.1.5.3. Nhiệt độ
Nhiệt độ là thông số quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng và các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật. Đểđánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến việc sản sinh enzyme của chủng Aspergillus niger GA15, tiến hành lên men xốp với cơ chất cám mì, độ ẩm 50% ở các nhiệt độ lên men khác nhau là 20, 25, 30, 35, 40 và 45°C.
Kết quả (Bảng 4.5, Hình 4.6) cho thấy, ở dải nhiệt độ từ 20 - 45oC, hoạt tính của 3 loại enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 là khác nhau rõ rệt (p<0,05). Hoạt tính của glucoamylase đạt cao nhất ở 30oC với hoạt tính là 39,77 (U/g) và thấp nhất ở 45oC với hoạt tính 7,33 (U/g). Hoạt tính của enzyme α- amylase và celullase cũng có xu hướng tương tự, đạt cao nhất ở 30oC với hoạt tính của 2 enzyme tương ứng lần lượt là 52,24 và 22,77 (U/g), đạt thấp ở nhiệt độ 20, 40 và 45oC.
Bảng 4.5. Hoạt tính enzyme của chủng đột biến Aspergillus niger GA15
ở các nhiệt độ lên men khác nhau
Nhiệt độ (oC) Hoạt tính enzyme (U/g), n=3 Glucoamylase (Mean ± SE) α-amylase (Mean ± SE) Celullase (Mean ± SE) 20 14.77c ± 0.97 20.53c ± 1.39 6.01c ± 0.60 25 27,66b ± 2,17 38,94b ± 3,1 13,06b ± 1,72 30 39,77a ± 1,1 52,24a ± 1,56 22,77a ± 0.21 35 24.24b ± 1.68 34.05b ± 2.40 10,53b ± 0,33 40 13,22cd ± 0,58 18,3cd ± 0,83 10,66b ± 0.94 45 7,33d ± 1,15 9,89d ± 1.64 4.55c ± 0.33
Ghi chú: Các chữ cái trong cùng một cột khác nhau thể hiện sựsai khác có ý nghĩa (p<0,05)
Nhiệt độ thấp hơn hoặc cao hơn nhiệt độ tối ưu đều làm giảm sự sản xuất enzyme. Ở nhiệt độ thấp không thích hợp cho sựsinh trưởng của nấm mốc và kết quả là sự sản xuất enzyme giảm. Trong khi ở nhiệt độ cao sẽ làm giảm lượng nước của môi trường do bốc hơi dẫn tới ảnh hưởng đến sựsinh trưởng của các tế bào, thêm vào đó nhiệt độcao hơn sẽ làm giảm sự tập trung của oxy dẫn đến việc sản xuất enzyme giảm. Điều này cũng có thể được lý giải là do ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính và thay đổi cấu trúc (Bedan & cs., 2014).
Hình 4.6. Ảnh hưởng của nhiệt độlên men đến sinh tổng hợp glucoamylase,
Như vậy, nhiệt độ 30oC được tìm thấy là nhiệt độ tốt nhất cho sự sản sinh của glucoamylase, α-amylase và cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15 và được lựa chọn là nhiệt độ lên men thích hợp trong các nghiên cứu tiếp theo.
Nhiệt độ tối ưu cho sản sinh các enzyme khác nhau giữa các loài nấm là không giống nhau. Theo Vu & cs. (2010), lên men ở 30oC là điều kiện tối ưu cho sản xuất enzyme thủy phân tinh bột sống của chủng Aspergillus niger XN15. Ở nhiệt độ 35oC là thích hợp cho chủng Aspergillus NRRL 3112 và Aspergillus NRRL 337 để sản sinh glucoamylase (Ellaiah & cs., 2002). Kavya & Padmavathi (2009) cho biết chủng nấm sợi A.niger cho hoạt tính của xylanase cao nhất là 16 U/ml khi lên men xốp ở 45oC, thấp nhất ở 25oC. Varalakshmi & cs. (2009) báo cáo rằng sản xuất enzyme của chủng A. niger tốt nhất ở nhiệt độ phòng cả trong lên men chìm và lên men lỏng, Kathiresan & Manivannan (2006) lại cho rằng ở 30oC là nhiệt độ tốt nhất để sản xuất enzyme bởi chủng Penicillium fallutanum. Điều này cho thấy rõ ràng rằng quá trình sản xuất enzyme trong lên men xốp bịảnh hưởng nhiều bởi nhiệt độ. Đa số, nấm sợi cho sản sinh enzyme cao ở nhiệt độ 30oC - 37oC, tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu cho sản xuất enzyme được báo cáo là ở 30°C (Gupta & cs., 2008; Alva & cs., 2007).