- Số l−ợng TBCN Tỷ lệ TB chết
6. Cụm đơn dòng dòng hồng cầu (CFU-E) (14 ngày sau nuôi cấy)
4.2.3. Kết quả làm giảm thể tích dịch tế bào:
Để có ngân hàng TBG lớn, với hàng ngàn mẫu TBG, việc cô đặc dịch bảo quản và giảm bớt HC là vô cùng quan trọng. Nhiều tác giả trên thế giới, nhất là ở châu Âu họ đã giảm thể tích bảo TBG xuống còn ≤ 30%, tạo độ đậm đặc TBCN khá cao (từ 1 - 3 x 108/ml) (51, 82, 83, 88), đồng thời loại HC đạt > 50%, nh−ng vẫn giữ đ−ợc số l−ợng TBCN > 70% và TB CD34 > 80% (80, 83, 85, 86) (bảng 31).
Kết quả nghiên cứu hiện nay, bằng ph−ơng pháp ly tâm đơn thuần chúng tôi cũng đạt đ−ợc loại HC > 50% và giữ lại TBCN > 85%. Dịch tế bào đ−ợc đậm đặc cao (2,5 x 108/ml). Dịch này bảo quản lạnh - 1960C, sau tan đông nhanh chóng, cho kết quả khả quan (>90% tế bào đ−ợc hồi phục (sống) sau đông lạnh sâu (bảng 28, H.9). Kết quả này có thể ứng dụng cho việc xây dựng ngân hàng tế bào gốc, tr−ớc hết là ngân hàng TB MCR.
Bảng 31. Kết quả nghiên cứu loại hồng cầu của các tác giả
% tế bào còn lại Tác giả Ph−ơng pháp
loại hồng cầu n Tế bào đơn
nhân CD34 Ficoll 44 62±26 53±21 Percoll 5 70±25 66±20 Gelatin 7 85±15 93±19 Querol và cs[60] HES 107 85±12 88±11 Kogler và cs[85] HES 158 83±13 84±13 Eichler và cs[86] Ly tâm phân lớp 88 82.4 85.4 Zingsem và cs82] Ly tâm phân lớp 40 73.1 ±13.2 77.0 ±17.6 Sousa và cs[83] Ly tâm phân lớp 67 72.4 87.1
Ly tâm phân lớp 20 81.5±4.3 85.4±2.1 Của chúng tôi
(máu cuống rốn) Ly tâm + HES 3 85.8
Bảng trên cho chúng ta thấy sử dụng cùng ph−ơng pháp ly tâm phân lớp kết quả của chúng tôi t−ơng tự của tác giả Eichler và cs [86] nh−ng cao hơn hẳn kết quả của tác giả Zingsem và cs về cả số l−ợng tế bào có nhân và CD34 [82]. Tác giả Sousa và cs nghiên cứu trên 67 mẫu máu cuống rốn cũng bằng ph−ơng pháp ly tâm phân lớp thu đ−ợc tỷ lệ tế bào đơn nhân còn lại là 72.4% và CD34 là 87.1[83].
So sánh với các ph−ơng pháp khác, tỷ lệ tế bào đơn nhân còn lại của chúng tôi thấp hơn so với ph−ơng pháp loại hồng cầu sử dụng HES và Gelatin nh−ng cao hơn hẳn so với ph−ơng pháp sử dụng Ficoll và Percoll của Querol và cs[60]. Tuy nhiên khi so sánh tỷ lệ tế bào CD34 còn lại kết quả nghiên cứu của chúng tôi t−ơng tự với kết quả của tác giả Kogler sử dụng HES để loại HC và , thấp hơn kết quả thu đ−ợc của Queroll và cs (sử dụng HES và Gelatin loại HC) và cao hơn hẳn so với ph−ơng pháp sử dụng Percoll và Ficoll[60].
Để bổ sung và làm sáng tỏ thêm cho nhận xét trên đây, chúng tôi tiến hành thử nghiệm qui trình ly tâm kết hợp với dung dịch Hydroxyethyl starch
(HES) 6% để loại bớt hồng cầu. Kết quả ở bảng 21 cho thấy tỷ lệ loại hồng cầu cao hơn ph−ơng pháp ly tâm đơn thuần (62,1% so với 51%), tỷ lệ bạch cầu, bạch cầu lympho, mono, bạch cầu đoạn mất đi t−ơng ứng là 14.2%, 7.9%, 6.7%, 19.3% (bảng 32). Nh− vậy với quy trình ly tâm 500g, 6' kết hợp với HES làm tăng hiệu quả lắng hồng cầu nh−ng vẫn duy trì đ−ợc tỷ lệ mất tế bào.
Sử dụng các hoá chất Ficoll, Gellatin, percol có tác dụng làm sạch hồng cầu và bạch cầu hạt ốt hơn nh−ng phải trải qua nhiều công đoạn, sau đó phải loại bỏ hoá chất tr−ớc khi truyền cho bệnh nhân. Do đó kéo dài thời gian bảo quản sau tan đông, ảnh h−ởng đến chất l−ợng tế bào gốc. Chúng tôi cho rằng nên dùng ph−ơng pháp ly tâm đơn thuần hoặc ly tâm +HES nồng độ thấp (6%) có tác dụng làm tăng độ lắng hồng cầu. Nh− vậy tỷ lệ loại hồng cầu sẽ cao hơn, bạch cầu có nhân(trong đó có CD 34) mất ít hơn. Bằng ph−ơng pháp ly tâm +HES chúng tôi làm tăng tỷ lệ loại hồnh cầu(62%) so với ly tâm đơn thuần (51%), bạch cầu mất t−ơng tự (14.2%) so với (14,5%), với bạch cầu trung tính mất nhiều hơn (19,3%) so với ly tâm đơn thuần (18,5%), (bảng 20 và 32).
Bảng 32: Kết quả loại hồng cầu của đơn vị máu cuống rốn
bằng ly tâm 500g/ 6’ và HES
Tỷ lệ tế bào bị loại (%)
Mẫu HC BC lympho Mono BC đoạn
M 35 64.2 18.3 7.5 3.5 27.4
M 36 59.4 14.7 10.7 10.0 18.6 M 37 62.7 9.7 5.4 6.7 11.8 M 37 62.7 9.7 5.4 6.7 11.8
X 62.1 14.2 7.9 6.7 19.3
Nhận xét: Với quy trình ly tâm thích hợp( 500g/ 6’) với sự có mặt của HES làm tăng hiệu quả cảu ly tâm đơn thuần(62% so voí51%) loại BC (14.2 và 14.5%). Nh− vậy khi kết hợp HES voí− ly tâm giúp loại hồng cầu nhiều hơn mà BC mất <15%.
Với kết quả trên đây chúng tôi cho rằng nên dùng ph−ơng pháp ly tâm phân lớp 500g/6’ kết hợp HES 6%, ph−ơng pháp có hiệu quả loại hồng cầu tốt, mất ít bạch cầu, HES nồng độ thấp (6%) không ảnh h−ởng đến chất l−ợng tế bào gốc khi bảo quản và không có tác hại cho bệnh nhân do hoá chất bảo quản [51,83], rút ngắn đ−ợc thời gian chuẩn bị tr−ớc đông lạnh do đó làm tăng đời sống tế bào gốc.
Nh− vậy chỉ bằng ph−ơng pháp ly tâm đơn thuần hoặc ly tâm kết hợp với HES nồng độ thập để loại bớt hồng cầu theo tỷ trọng kết quả của chúng tôi t−ơng tự với các tác giả khác và đã loại đ−ợc bớt hồng cầu làm giảm thể tích bảo quản tế bào gốc tạo máu (70%)nh−ng vẫn thu đ−ợc l−ợng lớn tế bào gốc (85%) mà không cần dùng các hoá chất nh− Ficoll, percol, gelatin bổ sung vào túi tế bào gốc. Từ đó giảm thiểu các nguy cơ có hại cho tế bào gốc và ng−ời nhận ghép, giảm các công đoạn sau bảo quản ... do đó giảm chi phí xử lý và bảo quản túi tế bào gốc, nâng cao hiệu quả sử dụng của túi tế bào gốc t−ơng đông HLA ở mức đọ cao cho ghép tế bào gốc đồng loài. Mặt khác, có bảo quản đ−ợc lâu dài mới có điều kiện phát triển ghép tế bào gốc tự thân từ nguồn máu cuống rốn. Đây là một yêu cầu có giá trị thực tiễn cao của ngân hàng tế bào gốc máu cuống rốn (42, 47). Một trong các điều kiện quan trọng để có thể l−u trữ đ−ợc nhiều mẫu tế bào gốc là loại hồng cầu và giảm thể tích bảo quản (60,83,85). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi bằng ph−ơng pháp ly tâm phối hợp HES liều thấp đã loại > 60% hồng cầu, tập trung tế bào có nhân với độ đậm đặc cao (2- 3 x 108/ml dịch tế bào) và giảm thể tích bảo quản còn < 30% (tơng đơng 25 – 30ml). Kết quả này t−ơng ứng với kết quả của các tác giả Châu Âu (51, 83, 85). Một điều kiện khác cho bảo quản dài ngày tế bào gốc có kết quả chất l−ợng không bị giảm sút là duy trì nhiệt độ bảo quản, đây là điều kiện cho tế bào gốc sống lâu dài. ở nhiệt độ – 1960C sau quá trình làm lạnh chuẩn, tế bào ổn định trong điều kiện bảo quản lạnh sâu. Nếu nhiệt độ này luôn đ−ợc duy trì (tế bào ngâm liên tục trong ni tơ lỏng) thì tế bào có thể sống nhiều năm với hiệu quả sống đạt >90%[5,60,67,83]. Nghiên cứu hiện nay chúng tôi tiến hành theo quy trình chuẩn đã đ−ợc nhiều n−ớc áp dụng, đó
là: thu gom TBF từ các nguồn cung cấp tế bào gốc, sàng lọc bệnh nhiễm trùng, định nhóm máu ABO, Rh, HLA, làm sạch tế bào gốc , giảm hồng cầu, giảm thể tích bảo quản, xác định số l−ợng tế bào CD34, thực hiện quy trình đông lạnh theo 3 b−ớc: b−ớc 1 làm lạnh từ 40C ni tơ lỏng - 1960C, duy trì nhiệt độ, bảo quản trong 3 tháng làm tan đông trong chậu n−ớc ấm 370C, kiểm tra số l−ợng tế bào sống. Kết quả cho thấy tế bào sống đạt tỷ lệ cao > 90% (thay đổi từ 91- 95%) cho cả 3 nguồn tế bào gốc: máu ngoại vi huy động, máu cuống rốn, tuỷ x−ơng (bảng 26, biểu đồ 5). Kết quả chúng tôi t−ơng đ−ơng kết quả của các tác giả trong và ngoài n−ớc (5,64,83,88). Để có kết quả tế bào sống một điều kiện khác cũng cần chú ý đó là thể tích bảo quản không quá lớn (khoảng 25 - 30ml) và phải đ−ợc giữ trong hộp bằng inox (cassette) nhằm dàn đều và dàn mỏng dịch tế bào thì khi tan đông nhanh và đều, tế bào ổn định.
5. kết luận
và Các đóng góp của đề tài
1. Chuẩn hoá đ−ợc 3 quy trình: Thu gom tế bào gốc; Làm sạch xử lý tế bào gốc; Bảo quản -1960C tế bào gốc