Hai loài giun móc A. braziliense và A. ceylanicum khá giống nhau về đặc điểm hình thái. Do đó nếu chỉ dựa vào hình thái học để phân biệt 2 loài trên đòi hỏi ngƣời có nhiều kinh nghiệm trong định danh phân loại. Vì vậy, phƣơng pháp sinh học phân tử PCR-RFLP hỗ trợ trong việc nhanh chóng giám định các loài giun móc. Giúp xác định chính xác loài A. ceylanicum, đây là loài giun móc nguy hiểm vì có sự truyền lây trực tiếp từ động vật (chó, mèo) sang cho con ngƣời.
Các mẫu giun móc đƣợc tiến hành ly trích DNA. Các mẫu có độ tinh sạch cao (1.8 <OD260/OD280<2) và đạt nồng độ lớn hơn 50ng/ l đƣợc thực hiện để nhân đoạn gen ở vùng ITS1 bằng phƣơng pháp PCR sử dụng đoạn mồi Asteno đƣợc thiết kế chung cho các loài giun móc (A. caninum, A. braziliense, A. ceylanicum, U. stenocephala) (Yuanjia Liu, 2013).
Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn ITS1 của các loài giun móc trên gel agarose 1%
Từ trái sang phải, giếng M: thang chuẩn 100bp; giếng 1,2,3,4: các mẫu xuất hiện các band có kích thước khoảng 400bp
Kết quả phân tích PCR-RFLP
Các loài giun móc rất khó phân biệt nếu chỉ dựa vào kích thƣớc của sản phẩm PCR từ một đoạn mồi chung AR/AF với sự chệnh lệch về độ lớn chỉ vài base pair (404 bp-408 bp). Chính vì vậy, PCR-RFLP là phƣơng pháp giúp xác định chính xác các loài giun móc (Yuanjia Liu, 2013) bằng các dựa trên các sản phẩm cắt đặc hiệu của từng loài giun móc. Các sản phẩm PCR đƣợc lần lƣợt ủ với các enzyme cắt giới hạn tƣơng ứng: BstN1, BsuR1, và Tag1.
101
Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP của A. caninum
Từ trái sang phải, giếng M: thang chuẩn 100bp; giếng 1,2: chứa sản phẩm PCR được cắt bởi enzyme TagI
Qua hình 4.5 cho thấy, enzyme cắt giới hạn Taq1 cắt sản phảm PCR thành một band có kích thƣớc 307 bp và một band mờ có kích thƣớc 60 bp. Các mẫu bị cắt bởi enzyme Taq1 là những mẫu chứa loài giun móc A. caninum (Yuanjia Liu, 2013). A. caninum là loài giun móc phổ biến trên chó, đặc biệt là ở các nƣớc có khí hậu nhiệt đới và kết quả này phù hợp với nghiên cứu trƣớc đây ở Thái Lan (Traub, 2008), đồng thời phù hợp với các nghiên cứu trong nƣớc của Nguyễn Hồ Bảo Trân và ctv. (2015).
Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR – RFLP của A. ceylanicum
Từ trái sang phải, giếng M: thang chuẩn 100bp; giếng 1,2,3,4: chứa sản phẩm PCR được cắt bởi enzyme BstN1
Qua hình 4.6 cho thấy, enzyme cắt giới hạn BstN1 chỉ cắt sản phẩm PCR thành 2 band: một band có kích thƣớc 327 bp và một band mờ có kích thƣớc 77 bp. Dựa vào kết quả nghiên cứu của Yuanjia Liu (2013), với kiểu hình cắt nhƣ trên, chỉ cho 2 band, vậy mẫu trên đƣợc xác định là loài A. ceylanicum. Kết quả trên giống với các nghiên cứu của Nguyễn Hồ Bảo Trân và ctv. (2015) và Nguyễn Ngọc Đỉnh
và ctv. (2015) tìm thấy loài này ở phát hiện ra loài A. ceylanicum ký sinh trênchó lần lƣợt tại tỉnh Vĩnh Long, và tỉnh Đắk Lắk.
102
Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP của A. braziliense
M: thang chuẩn: 100bp. Giếng 1: sản phẩm PCR được cắt bởi enzyme BstNI
Hình 4.7 cho thấy sản phẩm cắt bởi enzyme BstN1 cắt sản phẩm PCR thành 3 band có kích thƣớc 210 bp, 122 bp và 76 bp với kiểu hình cắt nhƣ trên xác định đây là loài A.braziliense (Yuanjia Liu, 2013). Kết quả trên giống với các nghiên cứu trƣớc đây của Nguyễn Hồ Bảo Trân và ctv. (2015) và của ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP để xác định thành phần các loài giun móc ký sinh trên chó ở tỉnh Vĩnh Long và Nguyễn Ngọc Đỉnh (2015) địa bàn tỉnh Đak Lak Bằng phƣơng pháp định danh bằng PCR-RFLP chúng tôi ghi nhận thấy sự hiện diện của 3 loài giun móc ký sinh trên chó là loài A. caninum, loài A. ceylanicum và loài A. braziliense. Tuy nhiên, chúng tôi không ghi nhận đƣợc sự hiện diện của loài U. Stenocephala. Điều này có thể giải thích vì dung lƣợng mẫu trong phƣơng pháp PCR-RFPL chƣa đủ lớn để đại diện cho tất cả các loài giun móc.
Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR của T. canis
M: thang chuẩn: 100bp. Giếng 1: sản phẩm PCR của T. canis, giếng 2, 3: mẫu âm tính
Qua hình 4.8 cho thấy kết quả khuếch đại đoạn gene ITS2 bằng đoạn mồi đặc hiệu TF và TR cho với sản phẩm PCR có kích thƣớc 564 bp đặc trƣng cho loài Toxoxara canis. Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch và giải trình tự để dùng trong nghiên cứu về đặc điểm di truyền.
103
Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR của S. lupi
M: thang chuẩn: 100bp. Giếng 1, 2 sản phẩm PCR của S. lupi, giếng 3: mẫu âm tính
Qua hình 4.9 cho thấy kết quả khuếch đại đoạn một phần đoạn gene cox- 1 bằng đoạn mồi SF và SR cho với sản phẩm PCR có kích thƣớc 520 bp đặc trƣng cho loài S. lupi. Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch và giải trình tự để dùng trong nghiên cứu về đặc điểm di truyền S. lupi.
4.2.3 Kết quả giải trình tự gene ITS-1, ITS-2, và gene cox-1 và xây dựng cây phả hệ
4.2.3.1 Xây dựng cây phả hệ và quan hệ loài của A. caninum
Hình 4.10 Cây phả hệ và quan hệ loài của A. caninum
Qua so sánh trình tự gene ITS-1 của giun móc A. canium đƣợc thu thập tại ĐBSCL với các chủng A. canium đƣợc đăng ký trên Genbank cho thấy giữa các chủng A. caninum có độ tƣơng đồng cao về di truyền từ 98,5% - 99,45%. Cây phả hệ đƣợc xây dựng dựa trên phƣơng pháp Maximum Likehood. Kết quả phân tích cây phả hệ cho thấy loài giun móc A. caninum ở vùng ĐBSCL có quan hệ di truyền gần gũi với các mẫu A. caninum có nguồn gốc ở Trung Quốc (KJ840827) và vùng hạ lƣu sông Mekong (LC177194).
104
4.3.2.2. Xây dựng cây phả hệ và quan hệ loài của A. ceylanicum
Hình 4.11 Cây phả hệ và quan hệ loài của A. ceylanicum
Cây phát sinh loài đƣợc xây dựng bằng phƣơng pháp bootstrap. Qua phân tích cây phát sinh loài, cho thấy các loài giun móc A. ceylanium hình thành 2 nhánh chính.
Nhánh lớn gồm các loài A. ceylanicum có nguồn gốc từ các nƣớc Trung Quốc, Nhật Bản và Úc. Các loài trên chủ yếu có nguồn gốc từ chó hoặc mèo. Loài A. ceylanicum ở vùng ĐBSCL đƣợc thu thập trên chó đƣợc hiển thị trong 1 nhánh nhỏ bao gồm các loài A. ceylanicum có nguồn gốc từ ngƣời ở vùng Đông Nam Á nhƣ Malaysia (KC247745 và KF896595), Thái Lan (KC247727). Việc loài giun móc A. ceylanicum có nguồn gốc từ động vật (chó, mèo) lại hiện diện trong nhóm A. ceylanicum có nguồn gốc từ ngƣời cũng đƣợc phát hiện trong các nghiên cứu trƣớc đây (Yuanija Liu, 2014).
Qua phân tích trình tự gene ITS-1 của loài A. ceylanicum, chúng tôi thấy có sự tƣơng đồng cao giữa loài này đƣợc thu thập từ động vật (chó, mèo) và cả trên ngƣời 99%-100%. Điều này góp phần giải thích cho khả năng lây truyền từ động vật sang ngƣời của loài giun móc này.
105
4.3.2.3 Xây dựng cây phả hệ và quan hệ loài T. canis
Hình 4.12 Cây phả hệ và quan hệ loài của T. canis
Qua phân tích cây phát sinh loài, cho thấy giun đũa đƣợc phân chia thành 2 nhánh rõ rệt với 2 loài khác nhau. Nhánh lớn gồm các loài T. canis và nhóm còn lại là loài T. leonina. Phân tích khoảng cách di truyền cho thấy trình tự ITS2 của T. canis ở ĐBSCL có độ tƣơng đồng cao 99%-100% với các mẫu cùng loài ở Iran, Trung Quốc, Brazil, Nhật Bản. Mẫu T. canis của vùng ĐBSCL đƣợc nhóm chung với các mẫu T. canis từ các nƣớc Trung Quốc, Nhật Bản, Iran và Brazil. Trong đó, trình tự ITS-1 của loài T.canis ở ĐBSCL có trình tự hoàn toàn giống T.canis đƣợc thu thập tại Iraq (MF663783). T. canis có khoảng cách di truyền xa so với các loài T. leonina ở Trung Quốc T. leonina (JF837174), T. leonina (JF837177), T. leonina (JF837179). Điều này cho thấy chỉ thị phân tử ITS-2 hữu hiệu trong phân loại loài giun đũa trên chó.
106
4.3.2.4 Xây dựng phả hệ và quan hệ loài của S. lupi
Hình 4.13 Cây phả hệ và quan hệ loài của S. lupi
Qua phân tích cây phát sinh loài, cho thấy giun thực quản đƣợc phân chia thành 2 nhánh rõ rệt với 2 loài khác nhau. Nhánh lớn gồm loài S. lupi ký sinh trên chó (ngoài trừ MF403001 ký sinh trên cáo ở Peru) và nhánh nhỏ thuộc loài Spirocerca vulpis đƣợc thu thập từ cáo. Phân tích khoảng cách di truyền cho thấy trình tự gen cox-1 của loài S. lupi ở vùng ĐBSCL có độ tƣơng đồng cao 97.2% với mẫu S. lupi ở Ấn Độ (MH634010) và tách ra thành 1 nhóm nhỏ. S. lupi ở vùng ĐBSCL có mối quan hệ gần gũi với nhóm S. lupi ở Israel (MH634005.1 và MH633997.1) và ở Peru (MF403001) hơn so với nhóm mẫu còn lại ở Iran (MT522373.1), và Ấn Độ (MK577664.1). Kết quả trên cho thấy
cox-1 (DNA ty thể) là một chỉ thị phân tử triển vọng trong nghiên cứu giun thực quản trên chó.
4.3 ết quả nghiên cứu vòng đời của giun móc A. caninum
4.3.1 Đặc điểm và kích thƣớc của các giai đoạn ấu trùng A. caninum
Mẫu trứng giun móc A. caninum có cƣờng độ nhiễm >10.000 trứng /gram phân đƣợc tiến hành nuôi cấy theo dõi sự phát triển qua các giai đoạn ấu trùng đƣợc thể hiện qua bảng 4.18
107
Bảng 4.18 Đặc điểm và kích thƣớc của các giai đoạn ấu trùng A. caninum
Giai đoạn
ấu trùng Đặc điểm hình thái của ấu trùng
ích thƣớc (mm) (X¯ ±SE)
L1
Ấu trùng hình gậy, vỏ mỏng, màu xám nhạt, miệng hở, mập. Thực quản có hình giống củ hành, chiếm khoảng ¼ kích thƣớc ấu trùng và di chuyển chậm
0,27±0,01
L2
Ấu trùng hình gậy, vỏ mỏng, màu xám nhạt, miệng hở, dài và thon hơn L1. Thực quản có giống củ hành, chiếm khoảng ¼ kích thƣớc ấu trùng và di chuyển nhanh hơn L1.
0,42±0,01
L3
Ấu trùng hình gậy, vỏ dày, màu đậm, miệng đóng, có bao miệng, thân hình dài và thon hơn L1. Thực quản có hình trụ và di chuyển nhanh.
0,64±0,01
X: Kích thước trung bình; SE: Sai số chuẩn
Quá trình phát triển từ trứng đến giai đoạn ấu trùng gây nhiễm của A. caninum trải qua các giai đoạn:
Giai đoạn 1: trứng theo phân ra môi trƣờng bên ngoài chứa 2-4 phôi bào. Sau đó, phôi bào tiến hành phân chia tạo ra nhiều phôi bào và cuối cùng hình thành ấu trùng bên trong trứng.
108
Hình 4.15 Trứng hình thành ấu trùng bên trong (X40)
Giai đoạn 2 (ấu trùng L1): Sau một thời gian hoạt động bên trong trứng, ấu trùng phá vỡ vỏ trứng và chui ra ngoài hình thành ấu trùng L1. Ấu trùng có hình gậy, vỏ mỏng, màu xám nhạt, miệng hở và mập. Thực quản có hình giống củ hành, chiếm khoảng ¼ kích thƣớc ấu trùng, di chuyển chậm và có kích thƣớc là 0,27±0,01 mm. Căn cứ vào mô tả ấu trùng A. caninum của Bowman (2009), cho thấy ấu trùng giai đoạn này là ấu trùng kỳ 1, ký hiệu là L1.
Giai đoạn 3 (ấu trùng L2): Ấu trùng L1 hoạt động một thời gian sau đó ngừng hoạt động và lột xác để trở thành ấu trùng L2. Ấu trùng có hình gậy, vỏ mỏng, màu xám nhạt, miệng hở, dài và thon hơn L1. Thực quản có hình giống củ hành, chiếm khoảng ¼ kích thƣớc ấu trùng, di chuyển nhanh hơn L1 và có kích thƣớc 0,42±0,01 mm. Căn cứ vào mô tả ấu trùng A. caninum của Bowman (2010), cho thấy ấu trùng giai đoạn này là ấu trùng kỳ 2, ký hiệu là L2.
109
Hình 4.17 Môi và thực quản ấu trùng L1, L2 (X40)
Hình 4.18 Ấu trùng L2 (X40)
Giai đoạn 4 (ấu trùng L3): Gọi là ấu trùng gây nhiễm, ấu trùng L2 hoạt động một thời gian sau đó ngƣng hoạt động và lột xác hình thành ấu trùng gây nhiễm. Ấu trùng có hình gậy, vỏ dày, màu đậm, có thể thấy các cơ quan bên trong, miệng đóng, có bao miệng, thân hình dài và thon hơn L1. Thực quản có hình trụ, di chuyển nhanh và có kích thƣớc 0,64±0,01 mm. Căn cứ vào mô tả ấu trùng A. caninum của Bowman (2010), cho thấy ấu trùng giai đoạn này là ấu trùng kỳ 3, ký hiệu là L3. Ấu trùng L3 là ấu trùng gây nhiễm, chúng có khả năng hƣớng động tới vật chủ và có khả năng đi qua vật chủ về nơi ký sinh.
110
Hình 4.19 Ấu trùng L3 (X40)
Hình 4.20 Bao miệng ấu trùng L3 (X40)
Đặc điểm của ấu trùng A. caninum qua thí nghiệm trên phù hợp với nghiên cứu của Trịnh Văn Thịnh và ctv. (1963) ấu trùng giun móc hình thành bên trong trứng, ấu trùng 1 có chiều dài 120-240 µm, thực quản dài 50-62 µm. Ấu trùng 2 có kích thƣớc 280-370 µm, thực quản dài 50-62 µm. Ấu trùng 3 có kích thƣớc 550-650 µm, thực quản dài 80-85 µm.
Qua kết quả nghiên cứu về kích thƣớc của ấu trùng A. caninum cũng phù hợp với nghiên cứu của Lapage (1962), ấu trùng L1 có chiều dài tƣơng đƣơng 300 m, đáng chú ý là hốc miệng của L1 dài, phần thực quản rõ, hình bầu. Ấu trùng qua hai lần biến thái để hình thành L2 và cuối cùng thành L3. Ấu trùng L3 có một lỗ miệng hơi dài và đuôi nhọn. Ấu trùng L3 là dạng ấu trùng gây nhiễm, chúng có chiều dài gần bằng 485 µm.
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, sự phát triển của ấu trùng A. caninum
trong môi trƣờng phải trải qua ba giai đoạn, mỗi lần chuyển giai đoạn là 1 lần biến thái, có sự biến đổi về kích thƣớc và hình thái của thực quản ấu trùng.
111
4.3.2 ết quả theo dõi thời gian phát triển ấu trùng giun móc ở điều kiện phòng thí nghiệm
Mẫu đƣợc thực hiện trong phòng thí nghiệm có độ ẩm từ 60-80, nhiệt độ dao động 29-32oC. Kết quả đƣợc thể hiện qua Bảng 4.20
Bảng 4.20 Thời gian phát triển của ấu trùng A. caninum ở điều kiện phòng thí nghiệm
Nhiệt độ (OoC)
Độ ẩm Giai đoạn Thời gian phát triển ( ± SE) giờ
Thời gian phát triển
( ± SE) ngày
29-32 60-80
L1 31,5±1,30 1,3±0,10
L2 101±3,60 4,2±0,10
L3 125±3,80 5,2±0,15
Qua bảng cho thấy thời gian phát triển của ấu trùng đến giai đoạn gây nhiễm là khá ngắn trung bình 5,2 ngày. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Bowman (1999) thời gian phát triển từ trứng tới L3 khoảng 2-8 ngày, sự phát triển của ấu trùng phụ thuộc vào nhiệt độ môi trƣờng. Đồng thời, theo nghiên cứu của Bowman (2010) thì ấu trùng giun móc phát triển tốt ở nhiệt độ 23-30oC, môi trƣờng tối, ẩm nhƣng không quá ƣớt. Khi nhiệt độ cao hơn khoảng nhiệt độ thích hợp (23-30oC) sự phát triển sẽ diễn ra nhanh chóng.
4.3.3. ết quả nghiên cứu thời gian hoàn thành vòng đời của giun móc trong cơ thể chó
Thí nghiệm xác định thời gian hoàn thành vòng đời của giun móc đƣợc chia thành 2 nghiệm thức, ở mức gây nhiễm 500 ấu trùng/chó và 1.000 ấu trùng/chó, sau gây nhiễm 14 ngày mỗi ngày lấy mẫu phân chó xét nghiệm tìm trứng của A. caninum đƣợc thể hiện qua bảng 4.21 nhƣ sau:
Bảng 4.21 Thời gian hoàn thành vòng đời của giun móc trong cơ thể chó
Nghiệm thức Cƣờng độ gây nhiễm (ấu trùng/chó)
Phƣơng pháp gây nhiễm
Thời gian bắt đầu thải trứng (ngày)
1 500 Qua thức ăn 17
2 1.000 Qua thức ăn 17
Đối chứng Không gây nhiễm - -
Bảng 4.21 cho thấy thời gian phát hiện trứng A. caninum trong phân chó ở thí nghiệm 1 và 2 là 17 ngày. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với Levine
112
(1968) cho rằng dù bất kỳ đƣờng xâm nhập nào vào vật chủ thì thời gian hoàn thành vòng đời của A. caninum trong khoảng thời gian 14-21 ngày.
4.3.4. ết quả thời gian hoàn thành vòng đời của giun móc chó
Bảng 4.22 Tổng hợp thời gian hoàn thành vòng đời của giun móc
Qua bảng 4.22 cho thấy thời gian khép kín vòng đời của A. caninum ở chó trung bình là 27,7 ngày. Kết quả tổng hợp thời gian hoàn thành vòng đời của giun móc trong thí nghiệm nằm trong khoảng thời gian của Stenphen et al., (1996) đã nghiên cứu.
Hình 4.21 Sơ đồ tổng quát chu trình phát triển của A. caninum
TT Giai đoạn Thời gian hoàn thành (ngày)
1 Ấu trùng
L1 1,3
L2 4,2
L3 5,2
2 Ấu trùng phát triển thành giun trƣởng thành trong cơ thể chó
17
113
4.4 ết quả nghiên cứu về bệnh lý học ở chó nhiễm giun móc A. caninum