PCR (Polymerase Chain Reaction): Về mặt nguyên tắc, một chu kỳ nhiệt độ sẽ bao gồm 3 giai đoạn nhiệt độ: (1) Ðầu tiên nhiệt độ sẽ đƣợc đƣa lên 94oC, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi DNA sẽ bị mất đi, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn; giai đoạn nhiệt độ này đƣợc gọi là giai đoạn biến tính, (2) Kế đó nhiệt độ sẽ đƣợc hạ đến 55-65oC là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm dến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích, giai đoạn nhiệt độ này đƣợc gọi là giai đoạn bắt cặp (3) (Lê Văn Phủng, 2000), (3) Cuối cùng, nhiệt độ đƣợc đƣa lên 72o
C là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của enzyme Taq polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt nguồn cho sự tổng
44
hợp nên mạch bổ sung. Nhƣ vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã đƣợc nhân bản thành hai bản sao; và nếu chu kỳ này đƣợc lặp di lặp lại liên tục 30-40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản đuợc thành 230-240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao (Lê Văn Phủng, 2000; Nguyễn Nhƣ Hiền, 2012).
Hình 2.27 Sơ đồ khối minh họa nguyên tắc hoạt động của máy luân nhiệt với buồng ủ nhiệt bằng khí
(Nguồn: Phạm Hùng Vân, 2009)
Hình 2.28 Polymerase nhận diện đƣợc nucleotide ở đầu 3’ của mồi bắt cặp với nucleotide ở sợi khuôn nên trƣợt đƣợc trên sợi khuôn để tổng họp sợi bổ sung
(Nguồn: Phạm Hùng Vân, 2009)
PCR đa mồi (multiplex-PCR) trong chẩn đoán phân tử xác định và phân biệt KST
Đối với KST, cho đến nay đã có nhiều phƣơng pháp và kit chẩn đoán multiplex-PCR sử dụng phát hiện nhiều loài gây bệnh. Khi KST cùng tồn tại ở một vị trí, một vùng trong cơ quan của cơ thể, thì việc cùng lúc phát hiện và phân biệt đƣợc nhiều loài gây bệnh mang lại hiệu kinh tế và lợi ích cao hơn nhiều so với thực hiện đơn lẻ. Multiplex-PCR đã đƣợc xây dựng để ứng dụng chẩn đoán phân biệt các loài giun tròn/sán lá/sán dây (Nguyễn Văn Đề và Phạm Văn Khuê, 2009). Hƣớng sử dụng hệ gene ty thể trong nghiên cứu chẩn đoán loài kể cả ứng dụng multiplex-PCR đƣợc coi là có cơ sở vững vàng trong điều kiện hiện nay. Do có kích thƣớc nhỏ, tồn tại nhiều bản sao trong một tế bào (vài trăm/tế bào), cấu trúc là vòng DNA khép kín nên rất bền vững, cấu
45
trúc đơn gene liên tục thuận lợi cho PCR hoạt động, một tế bào cho nguồn khuôn DNA gấp hàng trăm lần so với hệ gene nhân nên phản ứng PCR có độ nhạy cao hơn. Điều này có ý nghĩa khi sử dụng tế bào trứng giun sán làm nguồn khuôn cho multiplex-PCR, vì chỉ cần một tế bào trứng đã cho hàng trăm phân tử DNA hệ gene ty thể. Nhiều công trình đã thiết kế multiplex-PCR chỉ sử dụng trứng giun/sán cung cấp nguồn khuôn DNA để tận dụng tính đơn giản thu mẫu (chỉ cần phân ngƣời bệnh, đối với nhiều KST phủ tạng và đƣờng ruột; đờm chất dịch hô hấp, đối với sán lá phổi) (Lê Thanh Hòa, 2010).
Gene/hệ gene ty thể của nhiều loài KST đã lần lƣợt đƣợc giải mã và đăng ký trong Ngân hàng gene thế giới, tạo cơ sở dữ liệu để có thể truy cập ứng dụng trong việc thiết kế mồi đặc hiệu từng loài cho multiplex-PCR và so sánh phân biệt trong chẩn đoán, giám định và phân loại. Có hàng ngàn hệ gene ty thể đã đƣợc giải trình tự và phân tích hoàn toàn, hàng trăm hệ gene ty thể khác đang từng phần đƣợc giải quyết, bao gồm tất cả mọi loài quan trọng từ bậc thấp đến bậc cao, từ động vật đơn bào đến động vật đa bào, cung cấp một hệ thống dữ liệu quan trọng cho các quá trình nghiên cứu gene, protein, tiến hoá, lịch sử tiến hoá, di truyền quần thể, quan hệ về loài, giống và nhiều lĩnh vực nghiên cứu quan trọng khác, trong đó có sử dụng dữ liệu để thiết kế mồi cho multiplex PCR (Beugnet, 2018). Ngoài ra, còn có thể sử dụng các gene đích của hệ gene nhân trong chiến lƣợc thiết kế phƣơng pháp PCR đa gene/đa mồi để chẩn đoán phân biệt (Nguyễn Văn Đề, 2007).
RFLP-PCR trong xác định đa dạng di truyền giun tròn
Hiện nay việc sử dụng các chỉ thị DNA (RAPD-PCR, RFLP-PCR, AFLP, SSR) ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu phân loại, phân tích đa dạng sinh học và xác định khoảng cách di truyền và quan hệ di truyền của các loài giun tròn, sán lá, sán dây, nguyên sinh động vật. Việc giám định thành phần loài và chẩn đoán phân biệt các loài giun sán ở Việt Nam bằng kỹ thuật PCR sử dụng chỉ thị di truyền hệ gene ty thể đã đƣợc một số tác giả thực hiện có hiệu quả, có nhiều công trình sử dụng RFLP-PCR trong chẩn đoán phân biệt KST đƣợc đăng tải phản ánh định hƣớng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật cao đối với lĩnh vực KST, phân tích các chỉ thị ADN cho phép đánh giá một cách chính xác mức độ đa dạng di truyền. Trƣớc hết, đó là nghiên cứu xác định loài giun tròn đầu tiên ở Việt Nam (Nguyễn Văn Đề và Phạm Văn Khuê, 2009; Lê Thanh Hòa và ctv. 2010). Sau đó các loài giun tròn, sán lá, sán dây khác lần lƣợt đã đƣợc thẩm định thành phần loài, cũng đã đƣợc thẩm định bằng sinh học phân tử hệ gene ty thể và lần lƣợt một số chuỗi gene đã đăng ký trong Ngân hàng Gene thế giới. Nguyễn Hồ Bảo Trân và ctv. (2014, 2016), đã
46
xác định thành phần loài của giun móc trên chó tại tỉnh Vĩnh Long. Nguyễn Văn Đỉnh và ctv. (2015) đã khuếch đại thành công và chỉ thị trạng thái loài bằng kỹ thuật RFLP-PCR vùng ITS về loài giun móc ở chó. Những kết quả bƣớc đầu này đã góp phần giải quyết một số vấn đề trong xác định thành phần loài giun tròn tại Việt Nam và đã làm cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu kit PCR để chẩn đoán xác định bệnh giun tròn. Đồng thời đó cũng là cơ sở dữ liệu quý báu cho khoa học trong nghiên cứu đa dạng sinh học và đóng góp vào hoạch định chiến lƣợc phòng chống bệnh do giun sán gây ra trên vật nuôi có hiệu quả ở Việt Nam (Nguyễn Văn Đề, 2007; Lê Thanh Hoà, 2010).
Một số đặc điểm phân tử của chỉ thị gene nhân ITS1 và ITS2 giun tròn
Hình 2.29 Sơ đồ hệ gene nhân tế bào
(Nguồn: Radka, 2019)
Trong tế bào cơ thể, ngoài hệ gene ty thể, hệ gene nhân tế bào với hàng chục triệu đến hàng trăm triệu nucleotide đƣợc phân bố trong các đơn vị sinh học là nhiễm sắc thể (NST). Số lƣợng NST trong mỗi loài có khác nhau. Hệ gene nhân và hệ gene ty thể biểu hiện với những sản phẩm riêng, hoạt động vừa có tính độc lập, vừa tƣơng tác và dĩ nhiên hệ gene ty thể chịu ảnh hƣởng của hệ gene nhân tế bào. Vì vậy, hệ gene nhân tế bào có hệ số thấp hơn hệ gene ty thể, tuy nhiên bất kỳ sự thay đổi nào của các gene quan trọng cũng dẫn đến sự biến đổi hệ gene có tính chất đặc trƣng của loài, Các gene thuộc hệ gene nhân nhƣ các gene ribosome 18S; 5.8S và 28S vùng gene ITS1; ITS2
thƣờng đƣợc dùng trong phân tích định loại KST. Điều đáng chú ý là ITS1 và
ITS2 có mức độ biến đổi ngoại loài rất cao, thích hợp dùng trong nghiên cứu di truyền phả hệ nguồn gốc các chủng, các thể trong cùng loài (Lê Thanh Hòa, 2008), Nguyễn Hồ Bảo Trân và ctv. (2014), Nguyễn Văn Đỉnh và ctv. (2015).
Hệ gene ty thể và ứng dụng trong nghiên cứu KST
Ngoài hệ gene trong nhiễm sắc thể, tế bào động vật đa bào còn có một phần hệ gene đƣợc mã hóa trong ty thể. DNA ty thể là phân tử sợi kép, dạng vòng, cả hai chuỗi đều mã hóa protein. Số gene còn lại mã cho các ARN chức năng (22 tARN, 2 rARN) (Anderson et al. 1981). Ty thể có kích thƣớc nhỏ, chứa gene tối cần thiết cho hoạt động sống của tế bào nhƣ Cytochrome c oxidase subunit I (Cox-1) một tiểu phần của enzyme trong chuỗi hô hấp, quyết
47
định sự sống còn của tế bào do vậy có sự bảo tồn rất cao. Sự thay đổi dù là nhỏ ở những gene nhƣ vậy là dấu hiệu có giá trị trong giám định và phân loại. Gene ty thể thƣờng đƣợc ứng dụng và Cox-1 thƣờng đƣợc sử dụng để so sánh, xác định, gọi tên phân loài gần nhau (dƣới loài) (Nguyễn Văn Đề, 2007), Dƣơng Đức Hiếu và ctv. (2016).