2.6.1 Công thức máu
Công thức máu, là một trong những xét nghiệm thƣờng quy đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các xét nghiệm huyết học cũng nhƣ xét nghiệm y khoa. Số lƣợng hồng cầu (đơn vị là lít hay mm3): thƣờng đƣợc ký hiệu là RBC (red blood cell) là số lƣợng hồng cầu có trong một đơn vị máu.
Nồng độ hemoglobin trong máu (g/l, g%, g/dl): thƣờng đƣợc đo hàm lƣợng hemoglobin trong máu.
Hematocrit (%): thƣờng đƣợc ký hiệu là HCT hay PCV, đây là phần trăm thể tích của máu mà các tế bào máu chiếm (chủ yếu là hồng cầu).
Các chỉ số hồng cầu
MCV (1 fl=10-15 lít) là thể tích trung bình hồng cầu, đơn vị thƣờng dùng là femtolit.
MCHC (g/dl. G/l) là nồng độ hemoglobin trung bình trong một hồng cầu. MCH (1pg=10-12g) là trọng lƣợng hemoglobin trung bình trong một hồng cầu, đơn vị thƣờng dùng là picogram.
Số lƣợng bạch cầu (mm3) WBC (white blood cell) là số lƣợng bạch cầu có trong một đơn vị máu.
Công thức bạch cầu (%): là tỷ lệ phần trăm các loại bạch cầu trong tổng số bạch cầu (bạch cầu trung tính, bạch cầu ái toan, bạch cầu đơn nhân trung tính, bạch cầu ái kiềm, bạch cầu đơn nhân lớn, bạch cầu huyết bào).
2.6.2 Chức năng của máu
Theo Nguyễn Đức Hƣng (2006) cho rằng máu lƣu thông trong hệ mạch và có các chức năng chính nhƣ sau:
2.6.2.1 Chức năng vận chuyển
- Máu vận chuyển oxy từ phổi đến các tế bào của cơ thể và ngƣợc lại vận chuyển khí carbonic từ tế bào về phổi để đƣợc đào thải ra môi trƣờng bên ngoài.
- Vận chuyển các chất dinh dƣỡng từ ống tiêu hoá đến các tế bào và vận chuyển các sản phẩm đào thải từ quá trình chuyển hoá tế bào đến cơ quan đào thải.
- Vận chuyển hormon từ tuyến nội tiết đến các tế bào đích.
- Ngoài ra máu còn vận chuyển nhiệt ra khỏi tế bào đƣa đến hệ thống mạch máu dƣới da để thải nhiệt ra môi trƣờng.
40
2.6.2.2 Chức năng cân bằng nước và muối khoáng
- Máu tham gia điều hoà pH nội môi thông qua hệ thống đệm của nó. - Ðiều hoà lƣợng nƣớc trong tế bào thông qua áp suất thẩm thấu máu (chịu ảnh hƣởng của các ion và protein hoà tan trong máu).
2.6.2.3 Chức năng điều hòa nhiệt
Máu còn tham gia điều nhiệt nhờ sự vận chuyển nhiệt và khả năng làm nguội của lƣợng nƣớc trong máu.
2.6.2.4 Chức năng bảo vệ
- Máu có khả năng bảo vệ cơ thể khỏi bị nhiễm trùng nhờ cơ chế thực bào, ẩm bào và cơ chế miễn dịch dịch thể, miễn dịch tế bào.
- Máu cũng có khả năng tham gia vào cơ chế tự cầm máu, tránh mất máu cho cơ thể khi bị tổn thƣơng mạch máu có chảy máu.
2.6.2.5 Chức năng thống nhất cơ thể và điều hòa hoạt động cơ thể
- Máu mang các hormon, các loại khí oxy và cacbonic, các chất điện gíải khác Ca2+, Na+, K+ để điều hòa hoạt động các nhóm tế bào, các cơ quan khác nhau trong cơ thể nhằm bảo đảm sự hoạt động đồng bộ của các cơ quan trong cơ thể.
- Bằng sự điều hòa hằng tính nội môi, máu đã tham gia vào điều hòa toàn bộ các chức phận cơ thể bằng cơ chế thần kinh và thần kinh-thể dịch.
Thành phần hữu hình
Hồng cầu (Erythrocytes): hồng cầu ở loài hữu nhũ có dạng hình dĩa tròn, lõm 2 bên, trong có chứa sắc tố màu đỏ, hồng cầu trƣởng thành lại không có nhân, ty thể hay ribôxôm (Nguyễn Đình Giậu, 2000), đƣờng kính khoảng 7,8 μm, kích thƣớc hồng cầu thay đổi tùy theo loài, không phụ thuộc vào kích thƣớc động vật. Ở các loài động vật nói chung kích thƣớc của hồng cầu tỷ lệ nghịch với số lƣợng hồng cầu (Lê Quang Long, 1996).
Theo kết quả nghiên cứu của Schalm et al. (1975) số lƣợng hồng cầu bình thƣờng ở chó là 5,5-8,5x106
/mm3 máu. Đối với Hoàng Toàn Thắng và ctv. 2006 thì số lƣợng hồng cầu bình thƣờng ở chó là: 6-8x106/mm3 máu
Theo tác giả (Hoàng Toàn Thắng và ctv. 2006) cho rằng hồng cầu tăng gặp trong các trạng thái mất nƣớc do tiêu chảy, nôn nhiều, sốt, các bệnh truyền nhiễm cấp tính có sốt cao hoặc thiếu dƣỡng khí. Hồng cầu giảm thƣờng gặp trong trƣờng hợp thiếu máu do KST, trúng độc, suy tủy.
41
Bạch cầu (Leucocytes): bạch cầu là những tế bào máu có kích thƣớc lớn hơn hồng cầu nhƣng số lƣợng ít hơn hồng cầu, hình dáng bạch cầu không cố định, có khả năng di động theo kiểu amip và có khả năng chui ra khỏi thành mạch. Bạch cầu là những tế bào giữ chức năng bảo vệ cơ thể chống lại các tác nhân gây hại xâm nhập đến cơ thể, bạch cầu có nhân, số lƣợng bạch cầu 9,4x103/mm3 máu (Nguyễn Đình Giậu, 2000).
Bạch cầu ái toan (Eosinophil) tăng gặp trong trƣờng hợp nhiễm ký sinh trùng, ở bệnh của da, ái toan xuất hiện trong các bệnh sốt cao, dị ứng, trúng độc và nó giảm gặp trong trƣờng hợp nhiễm trùng toàn thân (Hoàng Toàn Thắng và ctv. 2006).
Bạch cầu đơn nhân lớn (Monocytes) là bạch cầu có kích thƣớc lớn nhất. Bạch cầu đơn nhân lớn tăng trong nhiễm KST, virus, nhiễm trùng mãn tính, viêm loét nội tâm mạc, quá trình huyết nhiễm trùng. Ít khi thấy giảm loại bạch cầu này, thƣờng gặp trong các bệnh thiếu máu ác tính, nếu mất máu trong thời gian dài thì tiên lƣợng xấu (Hoàng Toàn Thắng và ctv. 2006).
2.7 Các phƣơng pháp chẩn đoán giun tròn trên chó
Chẩn đoán tìm các loài giun tròn ký sinh trên chó mèo gồm nhiều phƣơng pháp nhằm phát hiện các loài giun tròn ký sinh ở vật nuôi. Chẩn đoán giun tròn không chỉ dựa vào triệu chứng lâm sàng, những dẫn liệu dịch tễ học mà còn phải tìm thấy căn bệnh của chúng nhƣ trứng giun, ấu trùng hoặc giun tròn trƣởng thành trên cơ thể sống cũng nhƣ ở vật nuôi chết nhằm mang lại hiệu quả tốt trong chẩn đoán bệnh một cách chính xác giúp cho công tác phòng trừ có hiệu quả.
2.7.1 Chẩn đoán tìm giun tròn ở chó khi con vật còn sống 2.7.1.1 Dựa vào dịch tễ học của bệnh do giun tròn trên chó 2.7.1.1 Dựa vào dịch tễ học của bệnh do giun tròn trên chó
Mỗi loài giun tròn ký sinh có những đặc điểm khác nhau nhƣ điều kiện tự nhiên, sự hoạt động của con ngƣời, thức ăn, nƣớc uống, những điều kiện cần thiết cho sự phát dục của các loài giun tròn (nhiệt độ, ẩm độ) và động thái của giun tròn. Dựa vào các đặc điểm trên có thể tiên lƣợng bệnh, mặc dù chẩn đoán dịch tễ học chƣa cho kết quả chính xác nhƣng giúp bổ sung và định hƣớng cho những phƣơng pháp chẩn đoán sau này đƣợc chính xác hơn (Nguyễn Thị Kim Lan và ctv., 2008). Do đó việc điều tra yếu tố dịch tễ học không thể thiếu đƣợc trong phƣơng pháp chẩn đoán giun tròn trên chó nuôi tại các tỉnh ĐBSCL (Nguyễn Thị Kim Lan, 2012)
42
2.7.1.2 Dựa vào triệu chứng lâm sàng
Mỗi loài giun tròn có thể gây ra các triệu chứng khác nhau, gây bệnh trên những cơ quan khác nhau chúng có biểu hiện khác nhau. Do đó, việc chẩn đoán dựa vào triệu chứng chỉ định hƣớng nghi bệnh mà không thể kết luận chính xác về bệnh (Nguyễn Thị Kim Lan và ctv. 2008; Phạm Sỹ Lăng và ctv.
2015). Triệu chứng lâm sàng của bệnh giun tròn biểu hiện nặng hay nhẹ còn tùy thuộc vào tình hình dinh dƣỡng, sức đề kháng, mức độ cảm nhiễm.
2.7.1.3 Dựa vào điều trị để chẩn đoán
Mỗi loài giun sán nói chung thƣờng mẫn cảm với một số loại thuốc tẩy trừ nhất định hoặc nhiều loài KST mẫn cảm với một loại thuốc. Dựa vào đặc điểm đó mà ngƣời làm công tác thú y dùng thuốc tẩy trừ để chẩn đoán (Nguyễn Thị Kim Lan vàctv. 2008).
2.7.1.4 Các phƣơng pháp kiểm tra phân
Phƣơng pháp này nhằm tìm các loài trứng giun tròn trong phân. Trong chẩn đoán kiểm tra phân tìm trứng giun tròn ở vật nuôi gồm có nhiều phƣơng pháp chẩn đoán chung và chẩn đoán chuyên biệt trên 1 loài trứng giun nào đó (Phạm Sỹ Lăng và ctv. 2015).
Phƣơng pháp phù nổi
Nguyên lý cơ bản là dùng dung dịch có tỷ trọng nặng hơn tỷ trọng trứng giun tròn làm trứng giun nổi lên bề mặt của dung dịch đó (trong mẫu phân chó đƣợc sử dụng đồng thời dung dịch NaCl bão hòa tìm các trứng giun tròn thông thƣờng nhƣ giun tóc giun đũa, giun móc và dung dịch ZnSO4 bão hòà để tìm giun thực quản) Trứng của các loài giun đƣợc phân loại dựa vào đặc điểm hình thái, kích thƣớc, trứng phân chia phôi bào (Nguyễn Thị Kim Lan và ctv. 2008).
Phƣơng pháp đếm trứng Mc Master
Xác định cƣờng độ nhiễm trứng giun tròn trong một gram phân, đánh giá mức độ nhiễm bệnh và đánh giá hiệu quả sử dụng thuốc để tẩy trừ.
2.7.2 Phƣơng pháp chẩn đoán trên con vật chết
Phƣơng pháp chẩn đoán trên con vật chết có các phƣơng pháp mổ khám nhƣ phƣơng pháp mổ khám từng phần, phƣơng pháp này có thể tìm đƣợc tất cả các loài giun tròn ký sinh ở các giai đoạn phát triển khác nhau, ở các cơ quan mà chẩn đoán khi gia súc còn sống với các phƣơng pháp kiểm tra phân không thể phát hiện đƣợc, với phƣơng pháp này đánh giá đƣợc chính xác tỷ lệ nhiễm, cƣờng độ nhiễm giun sán, qua định danh phân loại hình thái học và sinh học phân tử có thể xác định đƣợc chính xác loài giun tròn gây bệnh. Đồng
43
thời có thể ghi nhận đƣợc bệnh tích và các tổn thƣơng do bệnh giun tròn gây ra (Phạm Sỹ Lăng và ctv. 2015). Có 3 phƣơng pháp: Phƣơng pháp mổ khám toàn diện, phƣơng pháp mổ khám tìm giun sán ở 1 cơ quan, phƣơng pháp mổ khám không toàn diện của Skrjabin and Petrov (1963). Mổ khám toàn diện là phƣơng pháp mổ khám giun sán ở tất cả các cơ quan, tổ chức của cơ thể để phát hiện giun toàn bộ hệ tiêu hoá, kể cả gan, tuỵ; hệ hô hấp; hệ bài tiết; hệ sinh dục; các tổ chức dƣới da. Mổ khám giun sán ở 1 cơ quan là phƣơng pháp phát hiện tất cả các loài giun, sán ký sinh ở 1 cơ quan nào đó của cơ thể. Ví dụ nhƣ, mổ khám tìm giun ở cơ quan tiêu hoá (Nguyễn Thị Kim Lan và ctv.
2008; Phạm Sỹ Lăng và ctv. 2015). Mổ khám không toàn diện là phƣơng pháp mổ khám tìm 1 loài giun sán nào đó trong cơ thể chó.
2.8 Các phƣơng pháp xác định loài giun tròn ký sinh ở chó
2.8.1 Phƣơng pháp xác định loài giun tròn bằng đặc điểm hình thái học
Hình thái học là phƣơng pháp cơ bản đƣợc sử dụng trong nhận diện và phân loại giun tròn trƣớc khi có các kỹ thuật hiện đại nhƣ sinh học phân tử và kỹ thuật miễn dịch. Phƣơng pháp xác định hình thái học là dựa vào đặc điểm hình dạng và cấu trúc của các loài KST đƣợc mô tả tại các khóa phân loài đã đƣợc hệ thống sẵn nhƣ chiều dài, kích thƣớc, tỷ lệ, hình dạng và ký chủ của giun tròn. Rất nhiều công trình trong nƣớc và thế giới đã sử dụng phƣơng pháp hình thái học trong nghiên cứu để xác định loài giun tròn gây bệnh trên chó và các loài có khả năng lây lan sang ngƣời nhƣ Phan Thế Việt và ctv. (1977), , Nguyễn Thị Lê và ctv. (1996), Lê Hữu Khƣơng (2005), Nguyễn Thị Kim Lan
và ctv. (2011), Phạm Sỹ Lăng và ctv. (2015). Qua đó có thể thấy, phƣơng pháp này đƣợc ứng dụng rất rộng rãi và là phƣơng pháp cơ bản đƣợc nhiều nghiên cứu áp dụng để xác định thành phần loài giun tròn trƣớc khi thực hiện các phƣơng pháp giám định loài bằng các phƣơng pháp sinh học phân tử.
2.8.2 Phƣơng pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán giun tròn trên chó PCR (Polymerase Chain Reaction): Về mặt nguyên tắc, một chu kỳ PCR (Polymerase Chain Reaction): Về mặt nguyên tắc, một chu kỳ nhiệt độ sẽ bao gồm 3 giai đoạn nhiệt độ: (1) Ðầu tiên nhiệt độ sẽ đƣợc đƣa lên 94oC, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi DNA sẽ bị mất đi, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn; giai đoạn nhiệt độ này đƣợc gọi là giai đoạn biến tính, (2) Kế đó nhiệt độ sẽ đƣợc hạ đến 55-65oC là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm dến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích, giai đoạn nhiệt độ này đƣợc gọi là giai đoạn bắt cặp (3) (Lê Văn Phủng, 2000), (3) Cuối cùng, nhiệt độ đƣợc đƣa lên 72o
C là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của enzyme Taq polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt nguồn cho sự tổng
44
hợp nên mạch bổ sung. Nhƣ vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã đƣợc nhân bản thành hai bản sao; và nếu chu kỳ này đƣợc lặp di lặp lại liên tục 30-40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản đuợc thành 230-240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao (Lê Văn Phủng, 2000; Nguyễn Nhƣ Hiền, 2012).
Hình 2.27 Sơ đồ khối minh họa nguyên tắc hoạt động của máy luân nhiệt với buồng ủ nhiệt bằng khí
(Nguồn: Phạm Hùng Vân, 2009)
Hình 2.28 Polymerase nhận diện đƣợc nucleotide ở đầu 3’ của mồi bắt cặp với nucleotide ở sợi khuôn nên trƣợt đƣợc trên sợi khuôn để tổng họp sợi bổ sung
(Nguồn: Phạm Hùng Vân, 2009)
PCR đa mồi (multiplex-PCR) trong chẩn đoán phân tử xác định và phân biệt KST
Đối với KST, cho đến nay đã có nhiều phƣơng pháp và kit chẩn đoán multiplex-PCR sử dụng phát hiện nhiều loài gây bệnh. Khi KST cùng tồn tại ở một vị trí, một vùng trong cơ quan của cơ thể, thì việc cùng lúc phát hiện và phân biệt đƣợc nhiều loài gây bệnh mang lại hiệu kinh tế và lợi ích cao hơn nhiều so với thực hiện đơn lẻ. Multiplex-PCR đã đƣợc xây dựng để ứng dụng chẩn đoán phân biệt các loài giun tròn/sán lá/sán dây (Nguyễn Văn Đề và Phạm Văn Khuê, 2009). Hƣớng sử dụng hệ gene ty thể trong nghiên cứu chẩn đoán loài kể cả ứng dụng multiplex-PCR đƣợc coi là có cơ sở vững vàng trong điều kiện hiện nay. Do có kích thƣớc nhỏ, tồn tại nhiều bản sao trong một tế bào (vài trăm/tế bào), cấu trúc là vòng DNA khép kín nên rất bền vững, cấu
45
trúc đơn gene liên tục thuận lợi cho PCR hoạt động, một tế bào cho nguồn khuôn DNA gấp hàng trăm lần so với hệ gene nhân nên phản ứng PCR có độ nhạy cao hơn. Điều này có ý nghĩa khi sử dụng tế bào trứng giun sán làm nguồn khuôn cho multiplex-PCR, vì chỉ cần một tế bào trứng đã cho hàng trăm phân tử DNA hệ gene ty thể. Nhiều công trình đã thiết kế multiplex-PCR chỉ sử dụng trứng giun/sán cung cấp nguồn khuôn DNA để tận dụng tính đơn giản thu mẫu (chỉ cần phân ngƣời bệnh, đối với nhiều KST phủ tạng và đƣờng ruột; đờm chất dịch hô hấp, đối với sán lá phổi) (Lê Thanh Hòa, 2010).
Gene/hệ gene ty thể của nhiều loài KST đã lần lƣợt đƣợc giải mã và đăng ký trong Ngân hàng gene thế giới, tạo cơ sở dữ liệu để có thể truy cập ứng dụng trong việc thiết kế mồi đặc hiệu từng loài cho multiplex-PCR và so sánh phân biệt trong chẩn đoán, giám định và phân loại. Có hàng ngàn hệ gene ty thể đã đƣợc giải trình tự và phân tích hoàn toàn, hàng trăm hệ gene ty thể khác đang từng phần đƣợc giải quyết, bao gồm tất cả mọi loài quan trọng từ bậc thấp đến bậc cao, từ động vật đơn bào đến động vật đa bào, cung cấp một hệ thống dữ liệu quan trọng cho các quá trình nghiên cứu gene, protein, tiến hoá, lịch sử tiến hoá, di truyền quần thể, quan hệ về loài, giống và nhiều lĩnh vực nghiên cứu quan trọng khác, trong đó có sử dụng dữ liệu để thiết kế mồi cho multiplex PCR (Beugnet, 2018). Ngoài ra, còn có thể sử dụng các gene đích của hệ gene nhân trong chiến lƣợc thiết kế phƣơng pháp PCR đa gene/đa mồi để chẩn đoán phân biệt (Nguyễn Văn Đề, 2007).
RFLP-PCR trong xác định đa dạng di truyền giun tròn
Hiện nay việc sử dụng các chỉ thị DNA (RAPD-PCR, RFLP-PCR, AFLP, SSR) ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu phân loại, phân tích đa dạng sinh học và xác định khoảng cách di truyền và quan hệ di truyền của các loài giun tròn, sán lá, sán dây, nguyên sinh động vật. Việc giám định thành phần loài và chẩn đoán phân biệt các loài giun sán ở Việt Nam bằng kỹ thuật PCR sử dụng chỉ thị di truyền hệ gene ty thể đã đƣợc một số tác giả thực hiện có hiệu quả, có nhiều công trình sử dụng RFLP-PCR trong chẩn