ĐBSCL
3.4.2.1 Phƣơng pháp kiểm tra phân
Cách lấy mẫu: Mẫu phân chó mới thải ra đƣợc thu thập ngẫu nhiên tại
các hộ nuôi chó vào các buổi sáng, mỗi mẫu lấy khoảng 5-10 gram hoặc lấy trực tiếp từ trực tràng, để trong lọ nhựa có nắp, dán nhãn ghi các thông tin: địa chỉ, hình thức nuôi, loại chó, tuổi, giới tính, trạng thái phân và các biểu hiện lâm sàng của chó dựa vào phiếu điều tra đƣợc bảo quản trong phích trữ lạnh mang về phòng thí nghiệm để kiểm tra xét nghiệm. Tiến hành thực hiện song song cả 2 phƣơng pháp phù nổi Willis và phù nổi với dung dịch sulfate kẽm bão hòa
Phƣơng pháp phù nỗi Willis: Cho 2-3 gram phân vào cối sứ nghiền và
57
cho vào lọ thủy tinh 5 ml sạch. Tiếp tục cho dung dịch muỗi bão hòa vào đến đầy lọ. Đặt lá kính lên miệng lọ, để yên 15-20 phút. Lấy lá kính đặt lên phiến kính và kiểm tra trên kính hiển vi, dựa vào hình dạng, tế bào phôi để nhận dạng trứng.
Phƣơng pháp phù nỗi với dung dịch sulfate kẽm bão hòa: Cho 2-3
gram phân vào cối sứ nghiền và cho vào một ít dung dịch sulfate kẽm bão hòa (ZnSO4 tinh thể 330 gram+nƣớc cất 1000 ml) dung dịch có tỷ trọng (1,36), lọc qua rây lƣợc, cho vào lọ thủy tinh 5 ml sạch. Tiếp tục cho dung dịch sulfate kẽm bão hòa đến đầy lọ. Đặt lá kính lên miệng lọ, để yên 15-20 phút. Lấy lá kính đặt lên phiến kính và kiểm tra trên kính hiển vi, dựa vào hình dạng, tế bào phôi để nhận dạng trứng (Markovics và Medinski, 1996).
Phƣơng pháp đếm trứng Mc Master: Trứng đƣợc đếm theo phƣơng pháp Mc Master. Đây là phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng để đếm trứng giun trong Thú Y. Buồng đếm Mc Master gồm 2 buồng đếm nhỏ đƣợc chia vạch để dễ đếm trứng. Mỗi buồng có kích thƣớc là 1 cm x 1 cm x 0,15 cm.
Các bước tiến hành
- Chỉnh cân song bằng, lót đĩa cân bằng giấy bóng mờ, cân 3 gram phân cho vào cốc thủy tinh có mỏ.
- Cho dung dịch ZnSO4 bão hòa vào ống đong 60 ml đến vạch số 42 ml. - Cho một ít dung dịch ZnSO4 trong ống đong vào cốc thủy tinh có mỏ có chứa 3 gram phân, tán nhuyễn mẫu phân bằng đũa Inox.
- Cho hỗn hợp trên qua rây lọc để lƣợc cặn bả.
- Hỗn hợp đã đƣợc lƣợc cho vào ống đong và cho thêm dung dịch ZnSO4 bão hòa vào ống đong đến vạch 45 ml.
- Lắc đều dung dịch trong ống đong bằng cách cho vào ống đong khoảng 15 đến 20 viên bi.
- Dùng pipet hút dung dịch trong ống đong, nhỏ vào buồng đếm Mc Master. - Để yên khoảng 3-5 phút, sau đó đƣa lên kính hiển vi với độ phóng đại 100 lần, kiểm tra đếm trứng và tính kết quả. Đếm cả hai buồng đếm theo quy luật đếm cạnh:
+ Số trứng đếm đƣợc là x (đã biết) + Dung tích mỗi buồng đếm là 0,15 cm3 + Số trứng trong một gram phân sẽ là Y Y= X x 100
58
Mẫu phân đƣợc lấy ngẫu nhiên tại các hộ nuôi chó ở những huyện/quận thuộc các tỉnh/thành phố khảo sát. Mẫu phân chó đƣợc phân chia theo các chỉ tiêu khảo sát sau:
Giống chó: Giống nội và lai, giống ngoại. Trong đó, nhóm giống chó
ngoại là giống chó có nguồn gốc từ nƣớc ngoài, có ngoại hình và đặc điểm giống đặc trƣng của một giống.
Nhóm giống chó nội là giống chó địa phƣơng và giống chó lai là giống chó có kiểu hình của nhiều giống chó khác nhau (có hơn hai đặc điểm giống trên 1 cá thể). Phân loại, nhận dạng giống chó dựa theo mô tả Dominique (2005), Phạm Ngọc Thạch (2010), Nguyễn Văn Thanh và ctv. (2012).
Tuổi chó: phân ra làm 3 nhóm lứa tuổi sau:1-12 tháng; 12-24 tháng; >24
tháng. Phƣơng pháp xác định tuổi chó dựa theo thông tin phỏng vấn chủ nuôi kết hợp với sự thay đổi của răng để ƣớc lƣợng tuổi đƣợc mô tả bởi Sisson (1959).
Phƣơng thức nuôi: nhốt và thả rông (chó nuôi nhốt là những cá thể chó
đƣợc nhốt trong chuồng, nhà hoặc vùng có hàng rào bao quanh. Chó thả rông là chó đƣợc đi lại tự do và không đƣợc kiểm soát hay nhốt lại).
Mùa: mùa mƣa (tháng 5 đến tháng 10), mùa khô (tháng 11 đến tháng 4
năm sau).
Bên cạnh đó còn có một số chỉ tiêu khác để phân tích sự tƣơng quan giữa tỷ lệ nhiễm và các yếu tố nguy cơ nhƣ:
Vệ sinh thú y: Chu kỳ tẩy giun định kỳ cho chó của chủ nuôi: 4-6 tháng/lần, 6-12 tháng/lần và không thực hiện. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phƣơng thức cho ăn đƣợc chia làm 3 phƣơng thức: Ăn trong khay cố
định, ăn dƣới nền/sàn nhà và kết hợp (vừa cho ăn trong khay và vừa cho ăn dƣới nền sàn).
Kiểu lông chó:Kiểu lông nhẵn và kiểu lông dài
Thể trạng chó: đƣợc chia thành 4 mức (WSAVA, 2013): thừa cân, trung
bình, ốm và rất ốm.
Định loại trứng giun tròn ký sinh trên chó: dựa vào đặc điểm hình
dạng, kích thƣớc, sự bố trí phôi bên trong của trứng thông qua những mô tả về hình dạng trứng giun ký sinh trên chó theo tác giả Soulsby (1982).
59
Xác định hệ số tƣơng quan giữa tỷ lệ nhiễm giun tròn trên chó đến các yếu tố nguy cơ
Hình 3.1 Mô tả phƣơng pháp xác định tỷ suất chênh
(Thrusfield, 2007)
a/b là tỷ lệ phát sinh bệnh trong nhóm phơi nhiễm
c/d là tỷ lệ phát sinh bệnh trong nhóm không phơi nhiễm
OR>1: khả năng mắc bệnh cao hơn khả năng không mắc bệnh.
OR=1 khả năng mắc bệnh tƣơng đƣơng với khả năng không mắc bệnh.
OR<1: khả năng mắc bệnh thấp hơn khả năng không mắc bệnh.
3.4.2.2 Xác định tình hình nhiễm giun tròn trên chó tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long bằng phƣơng pháp mổ khám
Phƣơng pháp mổ khám
Áp dụng phƣơng pháp mổ khảo sát từng phần của viện sỹ Skrjabin theo các trình tự nhƣ sau:
Chó sau khi đƣợc giết chết sẽ đƣợc mổ khám toàn diện ở một số cơ quan.
Hệ tiêu hóa: tách riêng các bộ phận thực quản, dạ dày, ruột non, ruột già,
gan, tụy, màng treo ruột.
- Thực quản và dạ dày: quan sát bên ngoài thực quản và dạ dày, nếu có các khối u sẽ mổ ra, thu nhặt giun cho vào lọ nƣớc sạch để giun chết tự nhiên, sau đó mổ dọc thực quản và dạ dày, quan sát và gắp những giun còn bám vào niêm mạc .
- Ruột non: cho ruột vào xô, dùng vòi nƣớc xả vào lòng ruột để dồn chất chứa vào xô. Sau đó lộn ngƣợc ruột, quan sát niêm mạc để thu nhặt giun tròn, chất chứa đƣợc dội rửa và lắng gạn.
60
- Gan và mật: cắt dọc túi mật và ống dẫn mật, sau đó cho toàn bộ gan và mật vào chậu nƣớc, dùng tay bóp nhẹ gan đẩy giun ra ngoài. Quan sát chất chứa trong chậu, tìm giun và thu nhặt.
- Tuyến tụy: kiểm tra tƣơng tự nhƣ gan.
Địa bàn nghiên cứu
Đề tài đƣợc thực hiện tại các lò giết mổ chó tại các tỉnh khảo sát.
Đối tƣợng nghiên cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chó đƣợc khảo sát là chó đƣợc tìm hiểu và xác định có nguồn gốc tại các tỉnh khảo sát, những chó không xác định đƣợc nguồn gốc đƣợc loại trừ không đƣa vào nghiên cứu.
Mổ khảo sát ngẫu nhiên tìm giun tròn trên chó đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp mổ của Skrjabin and Petrov (1963)
Định danh phân loại
Mẫu giun tròn đƣợc thực hiện dựa vào một số đặc điểm về hình thái, cấu tạo của giun dựa trên khóa định danh của các tác giả: Phan Thế Việt và ctv. (1977), Nguyễn Thị Lê (1996), Bowman et al. (2003) và mô tả của Soulsby (1982).
Xác định cƣờng độ nhiễm
Cƣờng độ nhiễm giun tròn bằng phƣơng pháp đếm số lƣợng giun ký sinh/1 cá thể chó, với phƣơng pháp mổ khám, thu thập và đếm số lƣợng giun ký sinh cho mỗi chó (Nguyễn Thị Kim Lan và ctv. 2017).
3.4.2.3 Khảo sát sự tƣơng quan giữa số lƣợng giun móc hoặc số lƣợng giun móc cái trong ruột chó với số trứng trong một gram phân tƣơng ứng
Chỉ tiêu khảo sát
Thiết lập phƣơng trình tƣơng quan giữa tổng số giun móc hoặc số giun móc cái với số trứng trong 1 gram phân
Phƣơng pháp xác định phƣơng trình hồi quy tuyến tính
Chó đƣợc mổ khám để thu nhặt giun móc, định danh, đếm số giun cái và giun đực. Đồng thời mổ trực tràng của chó để lấy khoảng 10 gram phân. Mẫu phân đƣợc chọn là những mẫu phân có mức độ nhảo vừa phải. Mẫu phân đƣợc xét nghiệm và tính số trứng trong 1 gram phân theo phƣơng pháp Mc Master. Dó đó, trên mỗi chó sẽ có số giun và số lƣợng trứng giun tƣơng ứng. Số liệu đƣợc xử lý thống kê để tìm hệ số tƣơng quan và phƣơng trình tƣơng quan phù hợp.
61
3.4.3 Xác định loài giun móc, giun đũa, giun thực quản trên chó bằng đặc điểm hình thái học và sinh học phân tử tại các tỉnh, thành ĐBSCL
Đƣợc thực hiện qua sơ đồ định danh phân loại qua các bƣớc sau:
Hình 3.2 Sơ đồ thí nghiệm phân tích đặc điểm hình thái và sinh học phân tử của một số loài giun tròn trên chó
3.4.3.1 Xác định một số đặc điểm hình thái học loài giun móc
Mẫu sau khi thu thập đƣợc bảo quản trong phích đá rồi đem về phòng thí nghiệm KST để tiến hành xử lý mẫu thu thập mẫu giun tròn nguyên vẹn đƣợc bảo quản trong dung dịch barbagalo để xác định một số đặc điểm hình thái: phần đầu, miệng, môi, phần đuôi của giun đực, giun cái trƣởng thành. Dựa vào khóa phân loại giun tròn đƣợc các tác giả mô tả nhƣ: Phan Thế Việt và ctv.
(1977), Soulsby (1982), Nguyễn Thị Lê (1996), Bowman (2009).
3.4.3.2 Phƣơng pháp định danh giun tròn bằng kỹ thuật sinh học phân tử (PCR) và giải trình tự gene
Thu và trữ mẫu ly trích DNA
Chọn ngẫu nhiên 8 mẫu giun móc, 4 mẫu giun đũa và 2 mẫu giun xoăn thực quản tại các lò giết mổ của 6 tỉnh, thành ĐBSCL (An Giang, Đồng Tháp,
62
Kiên Giang, Bến Tre, Sóc Trăng và thành phố Cần Thơ). Mẫu đƣợc trữ trong dung dịch nƣớc muối sinh lý và đem về phòng thí nghiệm để ly trích DNA.
Tách chiết DNA từ mẫu giun tròn
Mẫu giun tròn đƣợc ly trích DNA theo các bƣớc sau:
Giun tròn đƣợc cắt nhuyễn cho vào tube đã chuẩn bị sẵn 700 µl dung dịch ly trích gồm digestion buffer, 70 µl SDS 10% và 18 µl protein K, sau khi vortex đƣợc ủ ở 37oC (12-24 giờ).
Mẫu đã ủ qua đêm đƣợc thêm 700 l phenol: chloroform lắc đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 25oC. Pha loãng phần trên mẫu sau ly tâm đƣợc chuyển sang tube mới sau đó thêm vào 700 l chloroform lắc đều. Tiếp tục hút phần dịch lỏng phía trên cho qua tube mới. Cho thêm 700 µl Isopropanol+70 µl NaOAC 2 mM. Ly tâm 10.000 vòng/5 phút. Sau đó, bỏ phần dịch nổi, thu lấy kết tủa DNA. Cho thêm 700 l ethanol 70%, lắc nhẹ. Ly tâm 10.000 vòng/5 phút. Bỏ phần dịch nổi, thu lấy kết tủa Ancylostoma và để khô DNA ở nhiệt độ phòng. Tiếp tục thêm 500 l TE 1X để ở nhiệt độ phòng 12-24 giờ. Sau đó DNA đƣợc trữ ở -20oC (Nguyễn Văn Đề, 2007; Butler, 2001).
Kiểm tra nồng độ DNA
Nồng độ DNA đƣợc xác định bằng máy UV-1800. Sản phẩm DNA đƣợc xác định nồng độ bằng phƣơng pháp đo quang phổ ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm. Nồng độ DNA đƣợc tính theo công thức sau:
CDNA= OD260 × K × 50 ng/µl (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
CDNA: nồng độ DNA
OD260: Chỉ số OD ở bƣớc sóng 260 nm K: hệ số pha loãng
Độ tinh sạch của DNA sau khi ly trích đƣợc xác định thông qua giá trị OD260/OD280, các mẫu đạt độ tinh sạch cao khi giá trị OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,8 đến 2. Chỉ sử dụng các mẫu có độ tinh sạch cao (1,8 <OD260/OD280< 2) và đạt nồng độ lớn hơn 50 ng/ l cho các công đoạn tiếp (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2001; Butler, 2001).
Thực hiện phản ứng PCR
Trình tự các cặp mồi, kích thƣớc sản phẩm dựa dùng trong xác định loài giun móc, giun đũa, và giun xoăn dựa trên các nghiên cứu đã đƣợc công bố của các tác giả đƣợc trình bày trong Bảng 3.4
63
Bảng 3.4 Trình tự primers dùng trong cắt sản phẩm PCR của giun
Tên loài Trình tự primer (5´- 3´) Chiều
dài sản phẩm (bp) Gene mục tiêu Nguồn tham khảo A. caninum AF:5’-CTTTGTCGGGAAGGTTGG- 3’ AR:5’-TTCACCACTCTAAGCGTCT- 3’ 404 ITS-1 Yuanjia Liu, 2013 A. ceylanicum 404 A. braziliense 408 U. stenocephala 406 T. canis TF:5´AAGCTGCACACATGTGGTG-3’ TR: 5’-ACCCTCAGCCAGACGTGC-3’ 564 ITS2 Tự thiết kế S. lupi SR:5’- TCTTTGTTGGTGGAGGTGCT- 3’ SF:5’- GACCCCACACAGAAGTACCC-3’ 520 Cox-1 Tự thiết kế
Thể tích dùng cho thực hiện phản ứng PCR là 20 µl chứa hỗn hợp chứa (10 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 200 mM deoxyribonucleotide triphosphate, 50 pmol đoạn mồi, 1.25 U Taq polymerase và 1 µl DNA template.
Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bảng 3.5 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR cho các loài giun móc
Giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
Tiền biến tính 96 5’ 1 Biến tính Gắn mồi Kéo dài 96 30’’ 35 60 30’’ 72 90’’ Kết thúc 72 7’ 1
64
Bảng 3.6 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR cho các loài giun xoăn thực quản
Giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
Tiền biến tính 96 5’ 1 Biến tính Gắn mồi Kéo dài 96 30’’ 35 58 60’’ 72 90’’ Kết thúc 72 7’ 1
Bảng 3.7 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR cho các loài giun đũa
Giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
Tiền biến tính 96 5’ 1 Biến tính Gắn mồi Kéo dài 96 30’’ 35 59 30’’ 72 90’’ Kết thúc 72 7’ 1 Bảng 3.8 Thành phần mix cho một phản ứng PCR STT Thành Phần Nồng độ gốc Nồng độ trong 1 thể tích phản ứng Thể tích cần hút (l) 1 Nƣớc khử ion 5,15 2 PCR buffer 10 x 1 x 1,00 3 MgCl2 25 mM 2,55 mM 1,00 4 dNTP 10 mM 0,25 mM 0,25
5 Mồi xuôi 10 pm/ul 0,25 pm 0,25
6 Mồi ngƣợc 10 pm/ul 0,25 pm 0,25
7 Taq polymerase 5,0 u/μl 0,50 u 0,10
8 DNA 50 ng/μl 100 ng 2,00
Tổng thể tích 10l
Phản ứng RFLP
Sản phẩm phản ứng PCR đƣợc ủ với enzyme cắt giới hạn đặc trƣng, sản phẩm thu đƣợc sẽ đƣợc điện di trên agarose 1% có bổ sung Ethium bromide ở điện thế 80 Volts trong 30 phút. Sản phẩm điện di đƣợc ghi lại bằng máy chụp hình gel.
65
Bảng 3.9 Enzyme sử dụng trong nghiên cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tên loài Tên primer Enzy me sử dụng Nhiệt độ, thời gian ủ mồi Vị trí cắt Tài liệu tham khảo A. caninum AF/AR Tag 1 65oC, 3 giờ 5’...TCG A.3' 3'...AGCT...5' Yuanjia Liu, 2013 A. ceylanicum BstN 1 37 oC, 16 giờ 5'...CCWGG..3' 3’ GGWC C... 5' Rebecca J. Traub, 2014 A. braziliense U.stenocephala BsuR 1 (Hae) 37oC, 3 giờ 5'...G GCC...3’ 3'...CCGG...5' Yuanjia Liu, 2013
Bảng 3.10 Dự đoán kiểu cắt hạn chế (restriction patterns) của các enzyme cắt giới hạn Enzyme BsuN 1 (Hae) và Tag 1 ở vùng ITS1
Loài PCR
(bp)
Vị trí cắt
Dự đoán chiều dài đoạn cắt (bp)
BstN 1 BsuR 1 (Hae) Tag 1
A. caninum 404 3+ 60, 307 (12U, 25U
A. ceylanicum 404 + 77, 327
A. braziliense 408 2+ 76, 122, 210
U. stenocephala 406 + 87,319
Bảng 3.11 Thành phần mix cho một phản ứng cắt enzyme
STT Thành phần Nồng độ Thể tích
1 Buffer 10 x 1 μl
2 Enzyme 10 u/μl 0,5 μl
3 H2O 9 μl
66
Phân tích sản phẩm PCR:
Sau khi tra mẫu, sản phẩm PCR đƣợc điện di trên thạch agarose 1,2%, với hiệu điện thế 100V trong 40 phút. Đọc kết quả bằng máy đọc và chụp ảnh gel.
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch và giải trình tự tại Công ty Phù Sa.
Giải trình tự
+ Đối với S. lupi với đoạn mồi xuôi _460 bp(5’-3’) + Đối với T. canis với đoạn mồi ITS1_527 bp(5’-3’)
+ Đối với giun A. caninum với đoạn mồi_AF_363bp (5’-3’) + Đối với giun A. ceylanicum với đoạn mồi_ AF_363bp (5’-3’)
So sánh cây phả hệ với các chủng trên ngân hàng gene trên thế giới với các loài giám định loài trên thể hiện qua bảng
Bảng 3.12 Tổng hợp các sequence của các loài giun tròn
Loài TT Số hiệu
Genbank
bp Quốc gia Năm
A. caninum 1 JX840458 404 China 2012 2 KC755019 404 china 2013
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});