L ời cảm ơ n
1.8. Tổng quan về virus Newcastle
LƯỢC TẠO VACCINE THẾ HỆ MỚI
Vaccine thiết kế dựa trên vector virus tái tổ hợp (recombinant virus-based vectoral vaccine) có vai trò quan trọng trong phát triển vaccine thế hệ mới, khả năng biểu hiện protein kháng nguyên từ nguồn gen của vi sinh vật trên đối tượng hưởng vaccine. Một số vector có khả năng kích thích miễn dịch niêm mạc huy động được tất cả các loại hình miễn dịch phòng chống bệnh. Vaccine cho động vật đã có trên 50 năm nghiên cứu chủ yếu bằng phương pháp truyền thống. Những tiến bộ về công nghệ DNA tái tổ hợp đã tạo nên bước nhảy vọt trong thiết kế vaccine sử dụng trong lĩnh vực thú y. Phát hiện và khám phá khả năng dùng virus đơn giản làm vector và phát triển công nghệ “di truyền ngược” (reverse genetics) để tái tổ hợp và lắp ráp virus mới, đã giải quyết một số bước có tính quyết định táo bạo tạo vaccine thế hệ mới. Virus Newcastle (NDV) là virus có vai trò dịch tễ học quan trọng ở gia cầm, là loại có hệ gen đơn sợi RNA, không phân đoạn, không khép kín, nên trở thành đối tượng lý tưởng tạo vector cho vaccine lưỡng dụng. Trong số các chủng tự nhiên của NDV, LaSoTa là chủng hoàn toàn vô độc, có khả năng kích thích miễn dịch niêm mạc, rất thuận lợi cho việc thiết kế vector sử dụng cho ăn/uống/khí dung.
Việc sử dụng vector virus đã đem lại lợi ích sinh miễn dịch với các kháng nguyên ngoại lai được biểu hiện tự nhiên trong phạm vi của tế bào nhiễm, do gây ra các đáp ứng miễn dịch tế bào cũng như đáp ứng miễn dịch dịch thể. Vì vậy, các vector vaccine virus tái tổ hợp hứa hẹn nhiều triển vọng phát triển trong tương lai. Trong công nghiệp chăn nuôi gia cầm hiện nay, bệnh do virus ở gia cầm gây thiệt hại nặng nề. Trong công nghệ vector sử dụng virus gia cầm, các loại virus herpes của gà tây, virus gây bệnh Marek’s, virus adeno và các thành viên trong họ retrovirus đã được sử dụng phổ biến như các vector biểu hiện (Dodds et al., 1999;
Jackwood, 1999). Hiệu quả bảo vệ của các virus tái tổ hợp này chống lại các bệnh ở
gia cầm đã được chứng minh. Tuy nhiên, việc ứng dụng vẫn cần được kiểm chứng lại những đặc tính cùng với các yếu tố được quan tâm chủ yếu như: tính an toàn, hiệu quả, và giá thành sản phẩm (Yokoyama et al., 1997; Jackwood, 1999)
NDV được sử dụng làm vector cho kiến tạo vaccine thế hệ mới đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng. Những đặc tính cơ bản của NDV cho
thấy NDV tái tổ hợp có khả năng biểu hiện protein ngoại lai tốt, sẽ trở thành vaccine có hiệu quả. NDV có thể nhân lên đến hàm lượng rất cao trong rất nhiều dòng tế bào và trứng và khả năng gây ra đáp ứng miễn dịch tế bào và dịch thể rất mạnh trong cơ thể.
NDV tự nhiên lây nhiễm qua đường hô hấp và qua bề mặt biểu mô nhày hệ thống tiêu hoá, vì vậy, loại virus này đặc biệt cần thiết cho việc loại bỏ các kháng nguyên bảo vệ của các tác nhân gây ra bệnh lý hô hấp. Thêm vào đó, các vaccine NDV sống đã được sử dụng rộng rãi tại Mỹ và hầu hết các nước khác. Các vaccine dựa trên NDV sống tái tổ hợp cũng có những thuận lợi hơn so với các vector vaccine tái tổ hợp khác. Trước tiên, protein ngoại lai chỉ được biểu hiện cùng với một vài protein NDV không làm nhiễu đáp ứng miễn dịch. Trái lại, vector virus herpes và một số virus kích thước lớn khác, nếu làm vector, ngoài biểu hiện protein kháng nguyên đích, còn có một lượng lớn các protein của chính vector được tổng hợp. Yêu cầu cơ bản của vector là chỉ biểu hiện ít protein vector chủ, tập trung biểu hiên protein kháng nguyên đích. Do vậy, NDV đáp ứng yêu cầu này. Thứ hai, NDV nhân lên trong tế bào chất của các tế bào nhiễm bỏ qua pha chuyển thành DNA, không có sự nạp gen của hệ gen virus vào trong DNA của tế bào chủ.
CHƯƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU
- Mẫu bệnh phẩm: Bệnh phẩm dùng trong nghiên cứu là chất thẩm dịch (exudate) và niêm mạc của hầu họng - khí - phế quản chứa virus cường độc cúm A/H5N1 thu thập từ gia cầm bị bệnh (gà, ngan, vịt), đã được vô hoạt bằng nhiệt độ, bảo quản ở -20oC. Huyễn dịch bệnh phẩm này được dùng làm nguồn nguyên liệu trực tiếp để tách chiết RNA tổng số. Mẫu bệnh phẩm được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu là 14 mẫu virus cúm A/H5N1 đại diện tại một số địa phương trong cả nước (Bảng 2.1).
- Mẫu vaccine: Là virus Newcastle chủng vaccine LaSoTa được thu nhận từ vaccine nhược độc đang được sử dụng rộng rãi tại Thái Lan, được xác định có tỷ lệ tương đồng trên 99% so với các chủng của Việt Nam và thế giới.
- Trứng gà SPF và trứng gà sạch mầm bệnh:
Trứng gà sạch các tác nhân gây bệnh đặc chủng (Specific Pathogen Free) được nhập từ Công ty Lohmann (CHLB Đức) có chứng chỉ kiểm định sạch 18 loại virus, các vi khuẩn chi Salmonella, Mycobacterium avium và Mycoplasmosis. Trứng SPF chủ yếu dùng để sản xuất giống cấp 1 và dùng làm đối chứng âm trong kiểm tra tính miễn dịch tồn lưu trong trứng và phôi.
Trứng dùng cho sản xuất vaccine thành phẩm phải được kiểm tra sạch H5N1, Newcastle và Salmonella, được sản xuất bởi những đàn gà trong các trại gà tập trung, có theo dõi dịch bệnh. Tiêu chuẩn sạch là trứng được kiểm tra sạch virus/kháng thể H5N1 và Newcastle. Trứng gà sạch do Trung tâm giống gia cầm Thụy Phương cung cấp.
- Gà thí nghiệm: Gà một ngày tuổi sạch H5N1 và Newcastle, được nuôi và tiêm phòng bệnh theo qui trình chăn nuôi công nghiệp hiện hành. Xác định độ sạch của gà về kháng thể và virus trước khi gây bệnh thực nghiệm. Lấy máu để xác định kháng thể kháng virus cúm H5N1 và swab (ổ nhớp và họng) để xác định độ sạch về mặt virus cúm type A bằng phương pháp realtime RT-PCR (RRT-PCR).
Bảng 2.1: Danh sách 14 chủng virus cúm A/H5N1 trong nghiên cứu đã được phân lập và giải trình tự
2.2. DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 2.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị 2.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị
-Máy PCR (máy PTC-100) của MJ. Research Inc. - Máy ly tâm lạnh.
- Máy soi gel và chụp ảnh Dolphin - DOC (Wealtec- Mỹ). - Bộ điện di DNA (Bio-Rad).
- Máy lắc có điều nhiệt, máy khuấy từ, máy vortex, lò vi sóng Samsung, box laminair vô trùng, tủ lạnh -20oC và -80oC (SANYO-Nhật Bản).
- Tủ ấm 370C.
- Bộ pipetman (10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl), đầu côn các loại, đĩa Petri, lọ đựng môi trường, và ống nuôi vi khuẩn...
2.2.2. Hóa chất
- Bộ kit tách chiết RNA tổng số, “QIAamp Viral Mini kit (QIAGEN Inc, USA)” và hoá chất do hãng QIAGEN cung cấp.
T T
Ký hiệu
chủng Danh pháp quốc tế Năm phân lập Nơi phân lập
1 DkQT801-2011 A/Duck/Vietnam/QT/801/2011(H5N1) 2011 Quảng Trị 2 DkQT802-2011 A/Duck/Vietnam/QT/801/2011(H5N1) 2011 Quảng Trị 3 CkKH-2010 A/Chicken/Vietnam/KH/2010 (H5N1) 2010 Khánh Hoà 4 Dk0970-09 A/Duck/Vietnam/0970/2009(H5N1) 2009 Sóc Trăng 5 CkDT382-08 A/Duck/Vietnam/DT382/2008(H5N1) 2008 Đồng Tháp 6 CkKG88-08 A/Chicken/Vietnam/KG88/2008(H5N1 2008 Trà Vinh
7 CkTV98-08 A/Chicken/VN/TV98/2008(H5N1) 2008 Kiên Giang
8 DkNA72-07 A/Duck/Vietnam/NA72/2007(H5N1) 2007 QL Nghê An
9 DkNA114-07 A/Dk/Vietnam/NA114/2007(H5N1) 2007 HN Nghệ An
10 DkMB2-07 A/Duck/Vietnam/MB2/2007(H5N1) 2007 GL, Hà Nội
11 DkAG-05 A/Duck/Vietnam/AG/2005(H5N1) 2005 An Giang
12 CkVL-05 A/Chicken/Vietnam/VL/2005(H5N1) 2005 Vĩnh Long
13 CkHD1-04 A/Chicken/Vietnam/HD1/2004(H5N1) 2004 HD, Hà Nội
- Bộ kit dùng cho phản ứng RT-PCR do hãng Invitrogen cung cấp.
- Bộ kit dùng cho phản ứng chuyển đổi cDNA do hãng Fermentas cung cấp. - Bộ kit dùng cho phản ứng PCR do hãng Fermentas cung cấp.
- Bộ kit dùng để tinh sạch sản phẩm PCR/RT-PCR do hãng QIAGEN và BIONEER cung cấp.
- Bộ kit dùng để tách DNA từ thạch agarose ”MinElute Gel Extraction Kit” do hãng QIAGEN cung cấp.
- Bộ kit tách dòng “TA-cloning kit” do hãng Invitrogen cung cấp. - Kháng sinh kanamycin, ampicilin (50 mg/ml), X-gal, cồn tuyệt đối.
- Bộ kit tách DNA plasmid tái tổ hợp, “QIAprep Spin Miniprep Kit” do hãng QIAGEN cung cấp.
- Bộ kit dùng cho phản ứng PCR giải trình tự.
- Bộ kit dùng để tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ phân tử virus cúm A/H5N1
Từ khuôn RNA tổng số tách chiết từ các mẫu bệnh phẩm của gia cầm mắc bệnh tại các địa phương từ năm 2004 - 2011, chúng tôi đã thực hiện các phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu để thu nhận các gen quan trọng là gen HA (H5) và gen NA (N1), lưu giữ trong plasmid và giải trình trình tự. Từ đó, truy cập Ngân hàng gen, so sánh đối chiếu và phân tích với các chủng của thế giới, nhằm tìm hiểu đặc tính sinh học phân tử và dịch tễ học phân tử của các chủng virus cúm gây bệnh tại Việt Nam (Hình 2.1).
2.3.1.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
RNA tổng số được tách chiết từ mẫu bệnh phẩm chứa virus bao gồm RNA của hệ gen virus cúm gà và RNA của tế bào. Chúng tôi sử dụng bộ hoá chất QIAamp Viral RNA kit để tách chiết RNA tổng số theo các bước sau:
Bước 1: Lấy 560 µl AVL/carrier RNA vào ống Eppendorf.
Bước 2: Thêm 140 µl huyễn dịch mẫu bệnh phẩm, trộn đều trên máy vortex 15 giây, để ở nhiệt độ phòng 10 phút.
Bước 4: Chuyển 630 µl hỗn dịch trên sang cột có màng lọc (QIAamp Mini Spin column), ly tâm tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ dịch phía dưới cột.
Bước 5: Lặp lại bước 4 với 630 µl hỗn dịch còn lại.
Bước 6: Sau khi ly tâm, thêm 500 µl đệm AW1, ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ dịch phía dưới cột.
Bước 7: Thêm 500 µl đệm AW2, ly tâm 13.000 vòng/1phút. Bỏ nước phía dưới và đem ly tâm lại 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 8: Chuyển cột QIAamp Mini Spin column sang ống Eppendorf sạch, thêm 60 µl đệm AVE để thôi RNA, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút thu được RNA tổng số, bảo quản mẫu ở nhiệt độ -200C hoặc -80oC.
Hình 2.1. Sơđồ nghiên cứu dịch tễ phân tử của virus cúm A/H5N1phân lập tại Việt Nam.
RNA tổng số Chuyển cDNA Phản ứng RT-PCR Phản ứng PCR Giải trình tự trực tiếp Dòng hóa TA trực tiếp vào vecto PCR 2.1
Tách chiết DNA của plasmid
(Plasmidtais tổ hợp dương)
Giải trình tự Chuỗi DNA ( đã xử lý)
Tìm kiếm/ so sánh/ tìm cấu trúc gen
Chuỗi DNA sản phẩm (cuối cùng) Phân tích xử lý chuỗi gen
So sánh đối chiếu Lập phả hệ
2.3.1.2. Phương pháp thực hiện phản ứng RT-PCR
Các đoạn gen nghiên cứu được thu nhận bằng phản ứng RT-PCR một bước (QIAGEN) với chu trình nhiệt và cặp mồi đặc hiệu.
Bảng 2.2:Danh sách các mồi sử dụng trong thu nhận, lưu giữ và giải mã gen H5 và N1
Tên mồi Trình tự chuỗi mồi (5’->3’)
Độ dài (bp) Vị trí bám trong gen Độ dài của sản phẩm thu được GEN HA (H5) (HEMAGGLUTININ) H5F1 ACATACTGGAAAGGACACACAACG 24 168-191 H5R1 GGCATACTAGAGTTTATCGCCC 22 924-945 H5F2 AGGACACACAACGGGAAGC 19 178-197 H5R2 CCATTGGAGTTTGACACTTGG 21 903-923 H3F1 CATCAACACTGAACCAGAGATTGG 24 681-704 H3R1 ACGATCCATTGGAGCACATCC 21 1682-1712 H3F2 GCTACTAGACCCAAAGTAAACGGGC 25 716-740 H3R2 GCACATCCATAAAGATAGACCAGC 24 1676-1699 H5F1-H5R1: 0,77kb H5F2-H5R2: 0,75kb H3F1-H3R1: 1,0kb H3F2-H3R2: 1,0kb H5BAMF CCGGGATCCTCTGTCAAAATGGAGAAAATAGTGCTT
(Đầu 5’ gen H5 có BamHI)
9+27 19-34 H5NOTR
ATAAGAATGCGGCCGCTCATTAAATGCAAAT TCTGCATTGTAACGA
(Cuối 3’ gen N1 có NotI) 16+27 1708-1735
H5BAMF- H5NOTR: 1733 bp (chứa toàn bộ gen H5) GEN NA (N1) (NEURAMINIDASE) N1P24N ACCGGCAATTCATCTCTTTGTCC 23 276-298 N1M13N2 ATTCAACCCAGAAGCAAGGCC 21 1275-1296 N1F1 AGCAAAAGCAGGAGATTAAAATG 23 1-23 N1R1 CTTGGTCCATCAGTCATTACAG 22 739-760 N1F1-N1R1: 0,76kb N1F2 GGAGGAACAACATACTGAGAACTC 24 690-713 N1R2 AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT 21 1460-1480 N1R3 CTACTTGTCAATGGTGAATGG 21 1427-1448 Cuối gen N1
N1ECOF CCGGAATTCAAAATGAATCCAAATCAGAAGATAATAACCATT
(Đầu 5’ gen N1 có EcoRI) 9+33 23-65
N1NOTR ATAAGAATGCGGCCGCTCACTACTTGTCAATGGTGAATGGCAA
(Cuối 3’ gen N1 có NotI) 9+33 1422-1445
N1ECOF- N1NOTR: 1370bp (chứa toàn bộ
gen N1)
2.3.1.3. Phương pháp chuyển đổi cDNA
Để thu nhận toàn bộ hệ gen chủng virus LaSoTa nghiên cứu, chúng tôi sử dụng phương pháp chuyển đổi RNA thành DNA bổ sung (cDNA) sử dụng mồi xác suất hexamer. Tiếp theo đó, sử dụng phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu để
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng chuyển đổi cDNA trong nghiên cứu Thành phần Thể tích RNA tổng số 3 µl Primer hexamer (100pM/µl) 1 µl dNTP mix (10mM) 1 µl H2O 9,5 µl 5X buffer 4 µl RiboLockTMRnase Inhibitor (20U/µl) 0,5 µl Maxima Reverse Transcriptase (20U/µl) 1 µl
TỔNG: 20 µl
Đây là một phương pháp mới được áp dụng gần đây trên thế giới. (Liu et al.,
2008; Wang et al., 2008). Mồi cung cấp cho phản ứng chuyển đổi cDNA là mồi
hecxamer do Fermentas cung cấp, đó là hỗn hợp đơn đoạn các đoạn oligonucleotide có 6 nucleotide bất kỳ, có khả năng bám xác suất vào sợi DNA đối xứng bổ sung với tần suất cao để tổng hợp kế tiếp nhau chuỗi nucleotide tạo nên hai sợi DNA là sản phẩm cDNA của toàn bộ hệ gen. Quá trình chuyển đổi được thực hiện trong một giờ ở 50oC, sau đó kết thúc phản ứng ở 850C trong 5 phút. Thành phần của phản ứng được trình bày ở bảng 2.3.
2.3.1.4. Phương pháp thôi gen và tinh sạh sản phẩm thôi gen
Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% và cắt lấy băng quan tâm. Sau đó gel được làm sạch (thôi gel) theo bộ kit AccuPrep® Gel Purification Kit (Bioneer):
- Cân gel theo quy ước : 1 mg tương đương với 1 µl. - Bố sung dịch GB theo tỉ lệ : Vmãu : VGB = 1 : 5 (µl).
- Ủ ở 60oC trong 10 phút, 2 phút mix nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 2 phút cho gel tan hoàn toàn.
- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Bổ sung 500 µl WB, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. - Thêm 500 µl WB để rửa sạch sản phẩm, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung thêm 1 phút để loại bỏ hết
dung dịch WB.
- Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5 ml.
- Hòa tan DNA trong 30 - 50 µl nước khử ion, khử trùng hoặc dung dịch EL, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, sau đó li tâm 13000 v/p trong 1 phút. Thu lấy phần dịch.
2.3.1.5. Phương pháp tách dòng và lưu giữ nguồn gen - Phương pháp ghép nối gen - Phương pháp ghép nối gen
Sau khi có sản phẩm RT-PCR của toàn bộ gen HA và NA, cần phải đưa đoạn gen đó gài vào trong một vector dẫn truyền (plasmid mang DNA) để có thể nhân lên một lượng lớn số lượng bản sao DNA plasmid (DNA tái tổ hợp). Các DNA plasmid sẽ được dùng để giải trình trình tự và lưu giữ nguồn gen.
Các phản ứng ghép nối được thực hiện với thành phần như sau:
Thành phần Thể tích (µl)
Đoạn gen cần nối (~200 ng) 0,5 – 4
Đệm 1
Nước cât đề ion khử trùng Thêm nước đển thể tích bằng 5
Vector 1
Tổng thể tích 6
Hỗn hợp phản ứng được ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng (22 - 25oC), sau đó được chuyển nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5 α-T1 (Invitrogen).
- Chuyển nạp vào tế bào
- Lấy 3 µl sản phẩm phản ứng nối (ligation) nói trên cho vào 50-100 µl tế bào khả biến E. coli DH5α-T1 (108-109 tế bào/ml)
- Ủ trong đá trong 45 phút. Sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây, - Ngay lập tức ủ lại vào đá trong 2 phút.
- Bổ sung 250 µl SOC. Lắc các ống tế bào ở 37oC với tốc độ 200 vòng/phút trong 1 giờ.
Sản phẩm chuyển nạp được trải đều trên đĩa thạch LB-agar 1,5% có bổ sung kháng sinh kanamycin (40 mg/ml) và X-gal (40mg/ml), ủ các đĩa này ở tủ ấm 37oC từ 18-20 giờ (qua đêm).
- Chọn lọc DNA tái tổ hợp