L ời cảm ơ n
2.3.1.5. Phương pháp tách dòng và lưu giữ nguồn gen
- Phương pháp ghép nối gen
Sau khi có sản phẩm RT-PCR của toàn bộ gen HA và NA, cần phải đưa đoạn gen đó gài vào trong một vector dẫn truyền (plasmid mang DNA) để có thể nhân lên một lượng lớn số lượng bản sao DNA plasmid (DNA tái tổ hợp). Các DNA plasmid sẽ được dùng để giải trình trình tự và lưu giữ nguồn gen.
Các phản ứng ghép nối được thực hiện với thành phần như sau:
Thành phần Thể tích (µl)
Đoạn gen cần nối (~200 ng) 0,5 – 4
Đệm 1
Nước cât đề ion khử trùng Thêm nước đển thể tích bằng 5
Vector 1
Tổng thể tích 6
Hỗn hợp phản ứng được ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng (22 - 25oC), sau đó được chuyển nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5 α-T1 (Invitrogen).
- Chuyển nạp vào tế bào
- Lấy 3 µl sản phẩm phản ứng nối (ligation) nói trên cho vào 50-100 µl tế bào khả biến E. coli DH5α-T1 (108-109 tế bào/ml)
- Ủ trong đá trong 45 phút. Sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây, - Ngay lập tức ủ lại vào đá trong 2 phút.
- Bổ sung 250 µl SOC. Lắc các ống tế bào ở 37oC với tốc độ 200 vòng/phút trong 1 giờ.
Sản phẩm chuyển nạp được trải đều trên đĩa thạch LB-agar 1,5% có bổ sung kháng sinh kanamycin (40 mg/ml) và X-gal (40mg/ml), ủ các đĩa này ở tủ ấm 37oC từ 18-20 giờ (qua đêm).
- Chọn lọc DNA tái tổ hợp
Sau 18-20 giờ, các đĩa thạch sẽ được lấy ra để chọn lọc các vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp. Chọn các khuẩn lạc có màu trắng vì đó là khuẩn lạc của các vi khuẩn có khả năng mang plasmid tái tổ hợp. Nuôi cấy các khuẩn lạc trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin hoặc ampicilin, các ống nuôi cấy được đưa vào máy lắc điều nhiệt với tốc độ 200 vòng/phút ở 37oC trong 18-20 giờ (qua đêm) để các tế bào sinh trưởng và nhân lên tạo nhiều bản sao mang vector tái tổ hợp.
- Tách chiết DNA tái tổ hợp
DNA plasmid tái tổ hợp được tách chiết sử dụng bộ kit QIAprep Spin Miniprep Kit của hãng QIAGEN theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tiếp theo được kiểm tra bằng enzyme giới hạn EcoRI.
Nếu điện di cho kết quả tương ứng với độ dài của sản phẩm PCR, thì DNA vector tái tổ hợp này được thu nhận và sẽ được tiến hành giải trình trình tự.