L ời cảm ơ n
3.3.1.3. Kết quả thu nhận đoạn gen F2 và chuyển nạp vào vector tách dòng
Từ RNA tổng số của hệ gen virus, bằng 2 phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu: N2.1F - N2.1R và N2.2F - N2.2R, chúng tôi đã thu được hai đoạn gen N2.1 và N2.2 của phân đoạn gen F2 có độ dài tương ứng khoảng 3 kb và 5 kb. Kết quả điện di kiểm tra được trình bày ở Hình 3.18.
Hình 3.18. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen N2.1 và N2.2 trong hệ gen virus
nhược độc vaccine LaSoTa.
Các sản phẩm RT-PCR được cắt hai đầu bằng enzyme giới hạn. Đoạn gen N2.1 cắt bằng Pfl23II/Esp3I; đoạn gen N2.2 cắt bằng Esp3I/MluI. Đồng thời vectơ pTZ cũng được cắt bằng hai enzyme giới hạn là Pfl23II/MluI. Các đoạn gen sau khi được cắt hai đầu được chuyển nạp vào tế bào khả biến DH10β. Tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc dương tính, nuôi cấy và tách DNA plasmid tái tổ hợp chứa toàn bộ gen F2. Như vậy chúng tôi đã thiết kế thành công plasmid có chứa pTZ-F2.
3.3.1.4. Kết quả thu nhận plasmid tái tổ hợp chứa toàn bộ hệ gen chủng virus vaccine LaSoTa
Từ hai vector pTZ-F1 và pTZ-F2, bằng các phản ứng cắt, nối, chúng tôi đã gắn được toàn bộ hệ gen của chủng virus vaccine LaSoTa nghiên cứu có độ dài khoảng 15 kb vào hệ thống vector pTZ và đặt tên vector này là pLaSoTa. Kết quả giải trình trình tự nucleotide đã khẳng định lại pLaSoTa chứa toàn bộ hệ gen của NDV chủng LaSoTa và có độ tương đồng là trên 99% so với các chủng đã đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế.
3.3.2. Kết quả lắp ghép gen H5 của virus cúm A/H5N1 vào plasmid vector LaSoTa tái tổ hợp
5kb 3 kb
Đầu tiên gen HA (H5) được cắt hai đầu bằng bởi enzyme hạn chế PauI. Tiếp theo đó, được cài vào giữa gen P và gen M trong hệ gen của virus LaSoTa (Hình 3.19).
Hình 3.19. Phương pháp gắn gen HA của virus H5N1 vào plasmid chứa hệ gen virus
LaSoTa và biểu hiện.
- Nguyên liệu gen HA: Ở đây, chủng virus cúm A/H5N1 được chọn để làm đối tượng nghiên cứu tạo virus tái tổ hợp là chủng DKNA-114, phân lập tại Nghệ An, Việt Nam năm 2007 - thuộc dòng Phúc Kiến.
- Quá trình lắp ghép virus tái tổ hợp được tiến hành ở BIOTEC - Thái Lan. - Phía Việt Nam cử một cán bộ nghiên cứu sang Thái Lan để cùng thưc hiện công việc.
- Trong thời gian thực hiện nhiệm vụ, phía Việt Nam tổ chức các đoàn ra để bàn kế hoạch hợp tác, thảo luận chiến lược và báo cáo khoa học tại BIOTEC - Thái Lan.
Sau khi có plasmid của toàn bộ hệ gen LaSoTa đã cài gen H5, plasmid này được chuyển nạp vào vector biểu hiện và chuyển nạp vào tế bào BHK-21. Sản phẩm tái tổ hợp gắn gen H5 sau khi biểu hiện được nhân lên nhiều đời trên phôi gà 9 ngày tuổi bằng cách tiêm virus tái tổ hợp vào xoang niệu mô và ấp ở 37oC liên tục trong
PauI PauI
PauI
dụng để tách chiết RNA tổng số, kiểm tra sự có mặt của gen H5 bằng phản ứng RT- PCR với cặp mồi đặc hiệu DK-HA-F và DK-HA-R. Kết quả được trình bày ở Hình 3.20.
Hình 3.20. Kết quảđiện di kiểm tra gen H5 của virus tái tổ hợp từ nước trứng của 3 lần
tiếp truyền.
Điện di kiểm tra sự có mặt của gen H5 cho thấy: Ở lần tiếp truyền thứ nhất, virus tái tổ hợp mang gen H5 nhân lên ít, chưa đủ để kiểm tra dương tính với phản ứng RT-PCR; ở lần tiếp truyền thứ hai, virus tái tổ hợp đã nhân lên nhiều hơn, cho phản ứng RT-PCR dương tính với cặp mồi đặc hiệu của gen H5; ở lần tiếp truyền thứ ba, lượng virus nhân lên đã nhiều, cho băng DNA rất đậm sau khi thực hiện phản ứng RT-PCR thu gen H5 (Hình 3.20).
Kết quả nghiên cứu trên cho thấy, đề tài đã thành công trong việc gắn gen kháng nguyên H5 của virus cúm A/H5N1 nghiên cứu vào plasmid vector tái tổ hợp chứa hệ gen của virus LaSoTa và đã tạo được virus tái tổ hợp LaSoTa-H5.
3.3.3. Kết quả kiểm tra giống virus tái tổ hợp
3.3.3.1. Bố trí thí nghiệm
Giống virus LaSoTa tái tổ hợp (LaSoTa-H5) mang gen H5 (do Viện Công nghệ sinh học - Việt Nam phối hợp với Viện Công nghệ di truyền và Công nghệ sinh học Quốc gia Thái Lan sản xuất) được đặt tên là DKNK và được kiểm tra khả năng nhân lên ổn định trên phôi trứng gà bằng phản ứng HA.
Trứng gà sử dụng trong nghiên cứu là trứng gà sạch (SPF) được nhập từ Đức và trứng gà sạch của Trung tâm giống gia cầm Thụy Phương. Sau khi nhập về, trứng được ấp ở tủ ấm 37oC với đầy đủ các điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm. Hàng ngày soi trứng kiểm tra để giữ lại những trứng phát triển tốt và bỏ đi những trứng chết
Tiếp truyền lần 1 Tiếp truyền lần 2
1,7 kb 1,7 kb
hoặc kém phát triển. Phôi trứng gà 10 ngày tuổi được sử dụng để tiếp truyền giống virus. Sau khi tiếp truyền virus 96 giờ, mổ trứng để thu hoạch nước trứng.
Nước trứng thu nhận từ xoang niệu mô của phôi gà 96 giờ sau khi tiêm virus LaSoTa tái tổ hợp DKNK được sử dụng làm nguyên liệu để tiếp truyền virus trên phôi gà sạch tiêu chuẩn 10 ngày tuổi đời tiếp theo với mục đích để nhân hàm lượng virus tái tổ hợp và sản xuất một lượng lớn cho kiểm tra đáp ứng miễn dịch trên gà.
Hình 3.21. Hình ảnh ấp trứng và tiếp truyền virus tái tổ hợp.
3.3.3.2. Kết quả chuẩn độ virus tái tổ hợp – xác định liều gây nhiễm EID50 của giống virus DKDK
Việc xác định liều gây nhiễm EID50 của virus tái tổ hợp DKNK trong các lô giống là rất quan trọng. Trên cơ sở của liều gây nhiễm EID50, dựa vào chỉ tiêu này để đánh giá được độ ổn định của giống.
- Nước trứng chứa virus LaSoTa tái tổ hợp DKNK thu hoạch từ các lần tiếp truyền virus được pha loãng ở 12 nồng độ khác nhau từ 10-1 đến 10-8 (Chú ý: Việc pha loãng virus có ý nghĩa rất lớn trong việc chuẩn độ virus, nên phải thực hiện chính xác với các dụng cụ chuẩn và tuyệt đối vô khuẩn).
- Ở mỗi nồng độ pha loãng virus tiêm cho 8 phôi gà đạt tiêu chuẩn. Kết quả xác định liều gây nhiễm 50% trứng (EID50) của giống virus được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3: Xác định liều gây nhiễm 50% trên phôi trứng gà (EID50) của giống virus LaSoTa tái tổ hợp DKNK mang gen H5 của virus cúm A/H5N1
Số thực tế Số tính toán F Số trứng có HA dương tính I N i n i n i + Tỷ lệ % 10-1 8/8 8 0 40 0 40/40 100 10-2 8/8 8 0 32 0 32/32 100 10-3 7/8 7 1 24 1 24/25 87 10-4 6/8 6 2 17 3 17/20 75 10-5 5/8 5 3 11 6 11/17 62 10-6 3/8 3 5 6 11 6/17 37 10-7 2/8 2 6 3 17 3/20 25 10-8 1/8 1 7 1 24 1/25 12 Ghi chú:
F: Độ pha loãng virus
I: Số trứng có HA dương tính ở mỗi nồng độ N:Số trứng có HA âm tính ở mỗi nồng độ
i: Số trứng có HA dương tính cộng dồn từ dưới lên n: Số trứng có HA âm tính cộng dồn từ trên xuống
Công thức Reed & Muench:
F X B F X LogA
EID log log log
log 50= + 1 = + 2 , , , 1 50 B A A X − − = và 2 50, ,, B A B X − − = Trong đó: - A: Số mũ nồng độ có HA dương tính cận trên 50% - B: Số mũ nồng độ có HA dương tính cận dưới 50% - A/: Tỷ lệ phần trăm cận trên 50% - B/: Tỷ lệ phần trăm cận dưới 50%
Theo kết quả thí nghiệm ở Bảng 1, dựa vào công thức ta có: Log(EID50) = Log 10-5 + (50 - 62)/(62 - 37) x log10
= -5 + (-0,48) = - 5,48 = Log 10-5,48
EID50 = 10-5,48
Như vậy, giống DKNK sau tiếp truyền có liều gây nhiễm EID50 trên phôi gà là 10-5,48, có nghĩa là với độ pha loãng virus 10-5,48 khi tiêm cho trứng thì có khả năng
3.3.3.3. Kết quả kiểm tra vô trùng, an toàn của giống virus tái tổ hợp
a) Kết quả kiểm tra vô trùng của giống vaccine
Để kiểm tra đặc tính vô trùng của giống virus tái tổ hợp, chúng tôi đã thực hiện cấy 0,2 ml dịch nước trứng thu được vào các ống môi trường sau: Thạch máu; Nước thịt; Nước thịt gan yếm khí và Thạch nấm. Môi trường được giữ trong tủ ấm 370C trong 72 giờ. Kết quả cụ thể như sau: Kiểm tra vô trùng Lô vaccine Thạch máu Nước thịt Yếm khí Thạch nấm 1 - - - - 2 - - - - 3 - - - - 4 - - - - 5 - - - -
Kết quả cho thấy ở tất cả các ống môi trường đều không có vi khuẩn mọc. Từ đó kết luận: Giống virus tái tổ hợp thu được đảm bảo chỉ tiêu vô trùng.
b) Kết quả kiểm tra an toàn của giống vaccine
- Giống virus tái tổ hợp được kiểm tra an toàn bằng cách gây nhiễm trên phôi gà sạch 10 ngày tuổi với liều gấp hai lần liều tiêm bình thường (0,4 ml/quả).
Kiểm tra vô trùng Lô vaccine Sống 24 giờ (%) Sống 48 gi(%) ờ Sống 72 gi(%) ờ Sống 96 gi(%) ờ Sống 120 gi(%) ờ 1 100 100 100 100 100 2 100 100 100 100 100 3 100 100 100 100 100 4 100 100 100 100 100 5 100 100 100 100 100
- Giống virus tái tổ hợp sử dụng cho thí nghiệm là nước trứng thu được qua tiếp truyền trên phôi gà 10 ngày tuổi.
Qua ba lần lặp lại thí nghiệm, kết quả đều cho thấy 100% số trứng được tiêm sống sau 120 giờ. Từ kết quả thí nghiệm trên cho thấy giống virus tái tổ hợp đảm bảo tính an toàn tuyệt đối trên phôi gà.
3.3.3.4. Kiểm tra tính ổn định của giống virus tái tổ hợp
Virus tái tổ hợp DKNK mang gen H5 được tiếp truyền nhiều đời trên phôi gà 10 ngày tuổi và kiểm tra tính ổn định bằng phản ứng HA. Số lần kiểm tra: 2 đợt (ở hai lần tiếp truyền). Quy trình thực hiện phản ứng được trình bày ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4: Quy trình thực hiện phản ứng HA Số thứ tự các giếng Nguyên liệu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PBS (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 *Kháng
nguyên (µl) 25 Trộn và chuyển 25 µl từ giếng số 1 đến giếng số 12
PBS (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Độ pha
loãng 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 1/4096 Hồng cầu
gà 1% (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
Kết quả kiểm tra cho thấy ở cả hai đợt, giống virus tái tổ hợp kiểm tra đều có hiệu giá HA đạt từ 1/64 đến 1/128 (4log2 – 7log2), điều đó chứng tỏ virus tái tổ hợp nhân lên tốt trong môi trường nước trứng qua các lần tiếp truyền.
3.3.3.5. Kết quả kiểm tra virus tái tổ hợp chứa gen H5 bằng sinh học phân tử
Nước trứng thu được qua các lần tiếp truyền được tách chiết RNA tổng số, kiểm tra sự có mặt của virus LaSoTa và H5N1 bằng phản ứng RT-PCR, với các cặp mồi đặc hiệu của gen H5 (virus cúm A/H5N1) và gen F (virus Newcastle/LaSoTa).
4,4 kb 2,3 kb 2,0 kb 0,54 kb C B M 1 2 1,7 kb 2 kb 1.8 kb M 1 A B
Hình 3.22. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR mẫu virus LaSoTa tái tổ hợp DKNK.
Ghi chú: A. M: Chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể Lamda được cắt bằng HindIII. 1,
thực khuẩn thể Lamda được cắt bằng HindIII. 1: Sản phẩm RT-PCR gen F của virus LaSoTa (1,7 kb).
Kết quả khảo sát sinh học phân tử đã xác định là trong các mẫu nước trứng nghiên cứu có sự có mặt gen F của virus LaSoTa và gen H5 của virus cúm A/H5N1
(Hình 3.22). Từ đó chứng minh sự có mặt của virus LaSoTa và virus cúm A/H5N1
trong mẫu virus tái tổ hợp.
3.3.4. Kết quả kiểm tra hiệu lực và đáp ứng miễn dịch của giống virus vaccine tái tổ hợp
3.3.4.1. Bố trí thí nghiệm
Nước trứng chứa virus tái tổ hợp DKNK (LaSoTa tái tổ hợp mang gen H5) của cúm A/H5N1 được sử dụng như một chế phẩm cung cấp virus làm kháng nguyên để thử nghiệm đáp ứng miễn dịch trên gà ở quy mô hẹp ở phòng thí nghiệm. Cách bố trí thí nghiệm như sau:
- Gà được bố trí làm ba lô:
+ Lô 1: 20 con. Thử nghiệm virus tái tổ hợp DKNK -1 (tiếp truyền đợt 1) + Lô 2: 20 con. Thử nghiệm virus tái tổ hợp DKNK -2 (tiếp truyền đợt 2) + Lô 3: 10 con. Đối chứng, không sử dụng virus tái tổ hợp DKNK
- Phương thức đưa vaccine:
+ Virus tái tổ hợp DKNK được đưa vào cơ thể gà qua đường uống + Thời gian đưa virus tái tổ hợp DKNK: 2 lần.
- Lần thứ nhất: Gà 2 tuần tuổi - Lần thứ hai: Gà 3 tuần tuổi + Liều lượng: 0,3 ml/con
- Sau khi đưa vaccine lần thứ hai 3 tuần, tiến hành lấy máu thu huyết thanh để kiểm tra hàm lượng kháng thể Newcastle và cúm A/H5N1 trong tất cả gà sử dụng gây miễn dịch virus tái tổ hợp DKNK và gà đối chứng (không sử dụng virus tái tổ hợp DKNK) bằng phản ứng HI.
- Địa điểm thực hiện thí nghiệm: Trại thí nghiệm của Viện Công nghệ sinh học (Hà Nội).
- Gà trống khoẻ mạnh, trọng lượng khoảng 1,5 – 2 kg, chưa được tiêm vaccine H5N1và Newcastle được sử dụng để thu hồng cầu.
- Kháng nguyên chuẩn H5N1 (do Viện Thú y Trung ương cung cấp)
- Kháng nguyên Newcastle (do Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương cung cấp) - Huyết thanh gà được tiêm virus tái tổ hợp DKNK -1 và DKNK -2.
3.3.4.2. Kết quả phản ứng HI kiểm tra kháng thể kháng virus cúm A/H5N1
Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng virus cúm A/H5N1 được thể
hiện ở hình 3.23.
Trong tổng số 20 mẫu huyết thanh kiểm tra, số mẫu có hiệu giá kháng thểđạt từ 4log2 trở lên sau 3 tuần tiêm vaccine là 15 mẫu (chiếm 75%).
1 tuần sau tiêm vaccine 3 tuần sau tiêm vaccine Ký hiệu mẫu Kết quả HI
Đánh giá Kết quả HI Đánh giá
Pos 7 log2 P 7 log2 P Neg 0 log2 N 0 log2 N
DKNK1 4 log2 P 6 log2 P DKNK2 3 log2 N 5 log2 P DKNK3 4 log2 P 6 log2 P DKNK4 3 log2 N 4 log2 P DKNK5 5 log2 P 6 log2 P DKNK6 4 log2 P 5 log2 P DKNK7 2 log2 N 3 log2 N DKNK8 2 log2 N 2 log2 N DKNK 9 4 log2 P 4 log2 P DKNK 10 3 log2 N 3 log2 N DKNK 11 4 log2 P 5 log2 P DKNK 12 3 log2 N 5 log2 P DKNK 13 4 log2 P 5 log2 P DKNK 14 4 log2 P 5 log2 P DKNK 15 5 log2 P 6 log2 P DKNK 16 2 log2 N 3 log2 N DKNK 17 4 log2 P 4 log2 P DKNK 18 3 log2 N 4 log2 P DKNK 19 4 log2 P 5 log2 P DKNK 20 3 log2 N 3 log2 N
Kết luận: Ở quy mô phòng thí nghiệm, vaccine tái tổ hợp có khả năng tạo
Hình 3.23. Kết quả phản ứng HI đánh giá hàm lượng kháng thể kháng virus cúm A/H5N1
3.3.4.3. Kết quả phản ứng HI kiểm tra kháng thể kháng Newcastle
Các mẫu huyết thanh thu nhận từ gà tiêm phòng virus tái tổ hợp DKNK (LaSoTa tái tổ hợp mang gen H5) được sử dụng để kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng Newcastle và cúm A/H5N1. Các mẫu huyết thanh được lấy từ gà 3 tuần tuổi sau khi sử dụng virus tái tổ hợp DKNK lần 2. Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng Newcastle được thể hiện ở hình 3.24.
Hình 3.24. Kết quả phản ứng HI đánh giá hàm lượng kháng thể kháng Newcastle.
Kết quả kiểm tra HI: Trong 20 mẫu huyết thanh nghiên cứu có 17 mẫu đạt hiệu giá từ 4log2 đến 7log2 (chiếm 84%). Từ hiệu giá kháng thể 4log2 trở lên gà có