L ời cảm ơ n
3.2.5.2. Thử nghiệm kit ELISA
Để bước đầu đánh giá độ nhạy và đặc hiệu của kit ELISA nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng 18 mẫu huyết thanh. Các mẫu huyết thanh này đã được xác định là có
10 mẫu có kháng thể kháng cúm A/H5N1 và 8 mẫu âm tính bằng phương pháp
huyết thanh học, sử dụng phản ứng HI.
Đồng thời cũng với 18 mẫu huyết thanh này, chúng tôi tiến hành kiểm tra phát hiện kháng thể kháng H5N1 bằng một bộ kit ELISA khác đã được thương mại
hóa trên thị trường do Công ty Công nghệ sinh học Shenzhen Lvshiyuan của Trung
Quốc cung cấp.
a) Kết quả phát hiện kháng thể kháng H5N1bằng bộ kit ELISA nghiên cứu:
STT Ký hiệu mẫu OD1 OD2 Trung bình Đánh giá
Pos 0,384 0,381 0,383 P Neg 0,072 0,066 0,069 N 1 VX1 0,258 0,224 0,241 P 2 VX2 0,242 0,252 0,247 P 3 VX3 0,362 0,296 0,329 P 4 VX4 0,195 0,18 0,1875 P
5 VX5 0,61 0,61 0,61 P 6 VX6 0,285 0,248 0,2665 P 7 VX7 0,291 0,282 0,2865 P 8 D1 0,089 0,084 0,0865 N 9 D2 0,092 0,088 0,090 N 10 D3 0,10 0,094 0,097 N 11 D4 0,074 0,082 0,078 N 12 D5 0,126 0,142 0,134 N 13 QT1 0, 404 0,379 0,3915 P 14 QT2 0,396 0,395 0,3955 P 15 QT3 0,248 0,227 0,2375 P 16 QT4 0,131 0,123 0,127 N 17 QT5 0,081 0,077 0,079 N 18 QT6 0,11 0,121 0,1155 N
Ghi chú: - Pos: Mẫu đối chứng dương (kháng thể kháng cúm A/H5N1)
- Neg: Đối chứng âm (nước sinh lý)
- VX1 - VX7: mẫu huyết thanh gà được tiêm vaccine cúm A/H5N1
- D1 - D5: Mẫu huyết thanh gà không tiêm vaccine
- QT1 - QT6: Mẫu huyết thanh gà ở Quảng Trị (vùng có nguy cơ nhiễm virus cúm A/H5N1)
Như vậy, sử dụng kit ELISA nghiên cứu, chúng tôi đã xác định: Trong 18
mẫu nghiên cứu thì có 10 mẫu huyết thanh dương tính với cúm A/H5N1 (bao gồm 7
mẫu tiêm vaccine và 3 mẫu huyết thanh gà ở vùng có dịch bệnh cúm A/H5N1); 8
mẫu âm tính với cúm A/H5N1 (bao gồm 5 mẫu huyết thanh gà bình thường không
tiêm vaccine và 3 mẫu huyết thanh của gà ở vùng gần nơi có dịch bệnh).
b) Kết quả phát hiện kháng thể kháng H5N1bằng bộ kit ELISA đối chứng:
Để kiểm tra độ nhạy của bộ kit ELISA nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng một bộ kit ELISA đã được thương mại hóa trên thị trường (là bộ kit ELISA của Công ty
Công nghệ sinh học Shenzhen Lvshiyuan - Trung Quốc) để kiểm tra so sánh.
STT Ký hiệu mẫu OD1 OD2 Trung bình Đánh giá
Pos 0,38 0,386 0,383 P Neg 0,078 0,068 0,073 N 1 VX1 0,248 0,242 0,245 P 2 VX2 0,242 0,250 0,246 P 3 VX3 0,380 0,360 0,370 P 4 VX4 0,195 0,188 0,763 P 5 VX5 0,66 0,58 0,62 P
6 VX6 0,28 0,242 0,270 P 7 VX7 0,36 0,28 0,32 P 8 D1 0,086 0,084 0,085 N 9 D2 0,092 0,088 0,090 N 10 D3 0,16 0,142 0,151 N 11 D4 0,074 0,082 0,078 N 12 D5 0,148 0,142 0,145 N 13 QT1 0, 482 0,392 0,437 P 14 QT2 0,396 0,396 0,396 P 15 QT3 0,242 0,21 0,226 P 16 QT4 0,128 0,126 0,127 N 17 QT5 0,088 0,072 0,080 N 18 QT6 0,115 0,121 0,118 N
Ghi chú: - Pos: Mẫu đối chứng dương (kháng thể kháng cúm A/H5N1)
- Neg: Đối chứng âm (nước sinh lý)
- VX1 - VX7: mẫu huyết thanh gà được tiêm vaccine cúm A/H5N1
- D1 - D5: Mẫu huyết thanh gà không tiêm vaccine
- QT1 - QT6: Mẫu huyết thanh gà ở Quảng Trị (vùng có nguy cơ nhiễm virus cúm A/H5N1)
Như vậy, sử dụng kit ELISA của Trung Quốc chúng tôi đã xác định: Trong
18 mẫu nghiên cứu thì có 10 mẫu huyết thanh dương tính với cúm A/H5N1 (bao
gồm 7 mẫu tiêm vaccine và 3 mẫu huyết thanh gà ở vùng có dịch bệnh cúm
A/H5N1); 8 mẫu âm tính với cúm A/H5N1 (bao gồm 5 mẫu huyết thanh gà bình
thường không tiêm vaccine và 3 mẫu huyết thanh của gà ở vùng gần nơi có dịch bệnh). Kết quả này là hoàn toàn phù hợp với kết quả xác định với kit ELISA của đề
tài.
c) Kết quả phát hiện kháng thể kháng H5N1bằng phản ứng HI:
Để kiểm tra so sánh độ nhạy của bộ kit ELISA nghiên cứu, chúng tôi đồng thời sử dụng phản ứng huyết thanh học (HI) là một phương pháp phổ biến trong các phòng thí nghiệm để kiểm tra so sánh. STT Ký hiệu mẫu Kết quả HI Đánh giá STT Ký hiệu mẫu Kết quả HI Đánh giá
Pos 7 log2 P 9 D2 1 log2 N
Neg 0 log2 N 10 D3 0 log2 N
2 VX2 6 log2 P 12 D5 1 log2 N 3 VX3 5 log2 P 13 QT1 4 log2 P 4 VX4 4 log2 P 14 QT2 5 log2 P 5 VX5 6 log2 P 15 QT3 6 log2 P 6 VX6 6 log2 P 16 QT4 2 log2 N 7 VX7 6 log2 P 17 QT5 2 log2 N 8 D1 1 log2 N 18 QT6 1 log2 N
Ghi chú: - Pos: Mẫu đối chứng dương (kháng thể kháng cúm A/H5N1)
- Neg: Đối chứng âm (nước sinh lý)
- VX1 - VX7: mẫu huyết thanh gà được tiêm vaccine cúm A/H5N1
- D1 - D5: Mẫu huyết thanh gà không tiêm vaccine
- QT1 - QT6: Mẫu huyết thanh gà ở Quảng Trị (vùng có nguy cơ nhiễm virus cúm A/H5N1).
Như vậy, bằng phản ứng HI chúng tôi đã xác định: Trong 18 mẫu nghiên cứu
thì có 10 mẫu huyết thanh dương tính với cúm A/H5N1 (bao gồm 7 mẫu tiêm
vaccine và 3 mẫu huyết thanh gà ở vùng có dịch bệnh cúm A/H5N1); 8 mẫu âm tính
với cúm A/H5N1 (bao gồm 5 mẫu huyết thanh gà bình thường không tiêm vaccine
và 3 mẫu huyết thanh của gà ở vùng gần nơi có dịch bệnh). Kết quả này là hoàn toàn phù hợp với kết quả xác định với kit ELISA của đề tài và kit ELISA đã được thương mại hóa của Trung Quốc.
Kết luận: Kit ELISA do đề tài tạo ra có độ nhạy và độđặc hiệu tương đương với kit ELISA của Trung Quốc đang bán trên thị trường và có độ tin cậy.
3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TẠO VIRUS LASOTA TÁI TỔ HỢP MANG GEN H5 ĐỂ THỬ NGHIỆM ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH
3.3.1. Kết quả thiết kế plasmid vector chứa hệ gen virus LaSoTa (pLST)
3.3.1. 1. Nguyên liệu và phương pháp tạo plasmid vector LaSoTa
- Quá trình thiết kế vector pLST được thực hiện tại Viện Công nghệ Di truyền và Công nghệ sinh học Quốc gia - Thái Lan (BIOTEC), phía Việt Nam cử cán bộ sang cùng thực hiện.
- Nguyên liệu sử dụng cho nghiên cứu là chủng virus vaccine LaSoTa đang sử dụng phổ biến ở Thái Lan. Chủng LaSoTa của Thái Lan có độ tương đồng rất
cao với các chủng LaSoTa của Việt Nam và thế giới (≥ 99,5%), do vậy hoàn toàn phù hợp để làm nguyên liệu sản xuất vaccine sử dụng tại Việt Nam.
Hình 3.15. Sơđồ bố trí thí nghiệm thiết kế vector chứa toàn bộ hệ gen chủng virus LaSoTa.
RNA tổng số bao gồm cả RNA hệ gen của virus được tách chiết bằng bộ sinh phẩm QIAamp Viral Mini Kit (QIAGEN) từ mẫu bệnh phẩm. Tiếp theo sử dụng phương pháp chuyển đổi RNA thành DNA bổ sung (cDNA) sử dụng mồi xác suất hecxamer. Bằng các phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu đã thu được các đoạn gen mong muốn của toàn bộ hệ gen bao gồm các đoạn gen N1.1 + N1.2 + N1.3 + N2.1 + N2.2. Các đoạn DNA thu được được chúng tôi chuyển nạp vào vector tách dòng pTZ57R/T (Fermentas) để lưu giữ. Tiếp theo bằng các phản ứng cắt enzyme giới hạn và tự nối đã thu được toàn bộ hệ gen của NDV (Hình 3.15).
3.3.1.2. Kết quả thu nhận phân đoạn gen F1 và chuyển nạp vào vector
Các plasmid đã được xác định có chứa đoạn N1.1 và N1.2 được cắt bằng 2 cặp enzyme giới hạn MluI và BclI; BclI và XbaI và tự nối trước khi gắn vào vectơ pTZ cũng có vị trí cắt cho MluI và XbaI. Kết quả điện di kiểm tra được trình bày ở Hình 3.16. Qua kết quả điện di cho thấy hai đoạn gen N1.1 và N1.2 đã được chuyển nạp thành công vào vector tách dòng.
Hình 3.16. Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt DNA plasimd tái tổ hợp bằng các enzyme giới
hạn. Giếng 1: thang DNA chuẩn (DNA của thực khuẩn thể λ được cắt bằng enzyme
HindIII); giếng 2: DNA plasmid tái tổ hợp đoạn gen N1.1 được cắt bằng enzyme Mlu1 và
BcII; giếng 3: DNA plasmid tái tổ hợp đoạn gen N1.2 được cắt bằng enzyme BcII và XbaI;
giếng 4: vector pTZ được cắt bằng Mlu1 và XbaI.
Hình 3.17. Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt DNA plasimd tái tổ hợp bằng các enzyme giới
hạn. Giếng 1 thang DNA chuẩn (DNA của thực khuẩn thể λ được cắt bằng enzyme
HindIII); giếng 2 DNA plasmid tái tổ hợp đoạn gen N1.1 + N1.2 được cắt bằng enzyme
Mlu1 và XbaI có độ dài khoảng 6 kb; giếng 3 DNA plasmid tái tổ hợp đoạn gen N1.3 được
cắt bằng enzyme XbaI và Pfl23II có độ dài khoảng 2,7 kb; giếng 4 vector pTZ được cắt
bằng Mlu1 và Pfl23II có độ dài khoảng 3 kb.
Tương tự, bằng các phản ứng cắt nối gen đã thu được đầy đủ gen F1 (bao gồm 3 đoạn gen N1.1 + N1.2 + N1.3) gắn trong vector pTZ. Kết quả cắt kiểm tra DNA plasmid tái tổ hơp chứa toàn bộ gen F1 được trình bày ở Hình 3.17.
3.3.1.3. Kết quả thu nhận đoạn gen F2 và chuyển nạp vào vector tách dòng
Từ RNA tổng số của hệ gen virus, bằng 2 phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu: N2.1F - N2.1R và N2.2F - N2.2R, chúng tôi đã thu được hai đoạn gen N2.1 và N2.2 của phân đoạn gen F2 có độ dài tương ứng khoảng 3 kb và 5 kb. Kết quả điện di kiểm tra được trình bày ở Hình 3.18.
Hình 3.18. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen N2.1 và N2.2 trong hệ gen virus
nhược độc vaccine LaSoTa.
Các sản phẩm RT-PCR được cắt hai đầu bằng enzyme giới hạn. Đoạn gen N2.1 cắt bằng Pfl23II/Esp3I; đoạn gen N2.2 cắt bằng Esp3I/MluI. Đồng thời vectơ pTZ cũng được cắt bằng hai enzyme giới hạn là Pfl23II/MluI. Các đoạn gen sau khi được cắt hai đầu được chuyển nạp vào tế bào khả biến DH10β. Tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc dương tính, nuôi cấy và tách DNA plasmid tái tổ hợp chứa toàn bộ gen F2. Như vậy chúng tôi đã thiết kế thành công plasmid có chứa pTZ-F2.
3.3.1.4. Kết quả thu nhận plasmid tái tổ hợp chứa toàn bộ hệ gen chủng virus vaccine LaSoTa
Từ hai vector pTZ-F1 và pTZ-F2, bằng các phản ứng cắt, nối, chúng tôi đã gắn được toàn bộ hệ gen của chủng virus vaccine LaSoTa nghiên cứu có độ dài khoảng 15 kb vào hệ thống vector pTZ và đặt tên vector này là pLaSoTa. Kết quả giải trình trình tự nucleotide đã khẳng định lại pLaSoTa chứa toàn bộ hệ gen của NDV chủng LaSoTa và có độ tương đồng là trên 99% so với các chủng đã đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế.
3.3.2. Kết quả lắp ghép gen H5 của virus cúm A/H5N1 vào plasmid vector LaSoTa tái tổ hợp
5kb 3 kb
Đầu tiên gen HA (H5) được cắt hai đầu bằng bởi enzyme hạn chế PauI. Tiếp theo đó, được cài vào giữa gen P và gen M trong hệ gen của virus LaSoTa (Hình 3.19).
Hình 3.19. Phương pháp gắn gen HA của virus H5N1 vào plasmid chứa hệ gen virus
LaSoTa và biểu hiện.
- Nguyên liệu gen HA: Ở đây, chủng virus cúm A/H5N1 được chọn để làm đối tượng nghiên cứu tạo virus tái tổ hợp là chủng DKNA-114, phân lập tại Nghệ An, Việt Nam năm 2007 - thuộc dòng Phúc Kiến.
- Quá trình lắp ghép virus tái tổ hợp được tiến hành ở BIOTEC - Thái Lan. - Phía Việt Nam cử một cán bộ nghiên cứu sang Thái Lan để cùng thưc hiện công việc.
- Trong thời gian thực hiện nhiệm vụ, phía Việt Nam tổ chức các đoàn ra để bàn kế hoạch hợp tác, thảo luận chiến lược và báo cáo khoa học tại BIOTEC - Thái Lan.
Sau khi có plasmid của toàn bộ hệ gen LaSoTa đã cài gen H5, plasmid này được chuyển nạp vào vector biểu hiện và chuyển nạp vào tế bào BHK-21. Sản phẩm tái tổ hợp gắn gen H5 sau khi biểu hiện được nhân lên nhiều đời trên phôi gà 9 ngày tuổi bằng cách tiêm virus tái tổ hợp vào xoang niệu mô và ấp ở 37oC liên tục trong
PauI PauI
PauI
dụng để tách chiết RNA tổng số, kiểm tra sự có mặt của gen H5 bằng phản ứng RT- PCR với cặp mồi đặc hiệu DK-HA-F và DK-HA-R. Kết quả được trình bày ở Hình 3.20.
Hình 3.20. Kết quảđiện di kiểm tra gen H5 của virus tái tổ hợp từ nước trứng của 3 lần
tiếp truyền.
Điện di kiểm tra sự có mặt của gen H5 cho thấy: Ở lần tiếp truyền thứ nhất, virus tái tổ hợp mang gen H5 nhân lên ít, chưa đủ để kiểm tra dương tính với phản ứng RT-PCR; ở lần tiếp truyền thứ hai, virus tái tổ hợp đã nhân lên nhiều hơn, cho phản ứng RT-PCR dương tính với cặp mồi đặc hiệu của gen H5; ở lần tiếp truyền thứ ba, lượng virus nhân lên đã nhiều, cho băng DNA rất đậm sau khi thực hiện phản ứng RT-PCR thu gen H5 (Hình 3.20).
Kết quả nghiên cứu trên cho thấy, đề tài đã thành công trong việc gắn gen kháng nguyên H5 của virus cúm A/H5N1 nghiên cứu vào plasmid vector tái tổ hợp chứa hệ gen của virus LaSoTa và đã tạo được virus tái tổ hợp LaSoTa-H5.
3.3.3. Kết quả kiểm tra giống virus tái tổ hợp
3.3.3.1. Bố trí thí nghiệm
Giống virus LaSoTa tái tổ hợp (LaSoTa-H5) mang gen H5 (do Viện Công nghệ sinh học - Việt Nam phối hợp với Viện Công nghệ di truyền và Công nghệ sinh học Quốc gia Thái Lan sản xuất) được đặt tên là DKNK và được kiểm tra khả năng nhân lên ổn định trên phôi trứng gà bằng phản ứng HA.
Trứng gà sử dụng trong nghiên cứu là trứng gà sạch (SPF) được nhập từ Đức và trứng gà sạch của Trung tâm giống gia cầm Thụy Phương. Sau khi nhập về, trứng được ấp ở tủ ấm 37oC với đầy đủ các điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm. Hàng ngày soi trứng kiểm tra để giữ lại những trứng phát triển tốt và bỏ đi những trứng chết
Tiếp truyền lần 1 Tiếp truyền lần 2
1,7 kb 1,7 kb
hoặc kém phát triển. Phôi trứng gà 10 ngày tuổi được sử dụng để tiếp truyền giống virus. Sau khi tiếp truyền virus 96 giờ, mổ trứng để thu hoạch nước trứng.
Nước trứng thu nhận từ xoang niệu mô của phôi gà 96 giờ sau khi tiêm virus LaSoTa tái tổ hợp DKNK được sử dụng làm nguyên liệu để tiếp truyền virus trên phôi gà sạch tiêu chuẩn 10 ngày tuổi đời tiếp theo với mục đích để nhân hàm lượng virus tái tổ hợp và sản xuất một lượng lớn cho kiểm tra đáp ứng miễn dịch trên gà.
Hình 3.21. Hình ảnh ấp trứng và tiếp truyền virus tái tổ hợp.
3.3.3.2. Kết quả chuẩn độ virus tái tổ hợp – xác định liều gây nhiễm EID50 của giống virus DKDK
Việc xác định liều gây nhiễm EID50 của virus tái tổ hợp DKNK trong các lô giống là rất quan trọng. Trên cơ sở của liều gây nhiễm EID50, dựa vào chỉ tiêu này để đánh giá được độ ổn định của giống.
- Nước trứng chứa virus LaSoTa tái tổ hợp DKNK thu hoạch từ các lần tiếp truyền virus được pha loãng ở 12 nồng độ khác nhau từ 10-1 đến 10-8 (Chú ý: Việc pha loãng virus có ý nghĩa rất lớn trong việc chuẩn độ virus, nên phải thực hiện chính xác với các dụng cụ chuẩn và tuyệt đối vô khuẩn).
- Ở mỗi nồng độ pha loãng virus tiêm cho 8 phôi gà đạt tiêu chuẩn. Kết quả xác định liều gây nhiễm 50% trứng (EID50) của giống virus được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3: Xác định liều gây nhiễm 50% trên phôi trứng gà (EID50) của giống virus LaSoTa tái tổ hợp DKNK mang gen H5 của virus cúm A/H5N1