L ời cảm ơ n
2.3.1.1. Phương pháp tách chiết RNAt ổng số
RNA tổng số được tách chiết từ mẫu bệnh phẩm chứa virus bao gồm RNA của hệ gen virus cúm gà và RNA của tế bào. Chúng tôi sử dụng bộ hoá chất QIAamp Viral RNA kit để tách chiết RNA tổng số theo các bước sau:
Bước 1: Lấy 560 µl AVL/carrier RNA vào ống Eppendorf.
Bước 2: Thêm 140 µl huyễn dịch mẫu bệnh phẩm, trộn đều trên máy vortex 15 giây, để ở nhiệt độ phòng 10 phút.
Bước 4: Chuyển 630 µl hỗn dịch trên sang cột có màng lọc (QIAamp Mini Spin column), ly tâm tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ dịch phía dưới cột.
Bước 5: Lặp lại bước 4 với 630 µl hỗn dịch còn lại.
Bước 6: Sau khi ly tâm, thêm 500 µl đệm AW1, ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ dịch phía dưới cột.
Bước 7: Thêm 500 µl đệm AW2, ly tâm 13.000 vòng/1phút. Bỏ nước phía dưới và đem ly tâm lại 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 8: Chuyển cột QIAamp Mini Spin column sang ống Eppendorf sạch, thêm 60 µl đệm AVE để thôi RNA, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút thu được RNA tổng số, bảo quản mẫu ở nhiệt độ -200C hoặc -80oC.
Hình 2.1. Sơđồ nghiên cứu dịch tễ phân tử của virus cúm A/H5N1phân lập tại Việt Nam.
RNA tổng số Chuyển cDNA Phản ứng RT-PCR Phản ứng PCR Giải trình tự trực tiếp Dòng hóa TA trực tiếp vào vecto PCR 2.1
Tách chiết DNA của plasmid
(Plasmidtais tổ hợp dương)
Giải trình tự Chuỗi DNA ( đã xử lý)
Tìm kiếm/ so sánh/ tìm cấu trúc gen
Chuỗi DNA sản phẩm (cuối cùng) Phân tích xử lý chuỗi gen
So sánh đối chiếu Lập phả hệ