L ời cảm ơ n
3.3.4.2. Kết quả phản ứng HI kiểm tra kháng thể kháng virus cúm A/H5N1
Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng virus cúm A/H5N1 được thể
hiện ở hình 3.23.
Trong tổng số 20 mẫu huyết thanh kiểm tra, số mẫu có hiệu giá kháng thểđạt từ 4log2 trở lên sau 3 tuần tiêm vaccine là 15 mẫu (chiếm 75%).
1 tuần sau tiêm vaccine 3 tuần sau tiêm vaccine Ký hiệu mẫu Kết quả HI
Đánh giá Kết quả HI Đánh giá
Pos 7 log2 P 7 log2 P Neg 0 log2 N 0 log2 N
DKNK1 4 log2 P 6 log2 P DKNK2 3 log2 N 5 log2 P DKNK3 4 log2 P 6 log2 P DKNK4 3 log2 N 4 log2 P DKNK5 5 log2 P 6 log2 P DKNK6 4 log2 P 5 log2 P DKNK7 2 log2 N 3 log2 N DKNK8 2 log2 N 2 log2 N DKNK 9 4 log2 P 4 log2 P DKNK 10 3 log2 N 3 log2 N DKNK 11 4 log2 P 5 log2 P DKNK 12 3 log2 N 5 log2 P DKNK 13 4 log2 P 5 log2 P DKNK 14 4 log2 P 5 log2 P DKNK 15 5 log2 P 6 log2 P DKNK 16 2 log2 N 3 log2 N DKNK 17 4 log2 P 4 log2 P DKNK 18 3 log2 N 4 log2 P DKNK 19 4 log2 P 5 log2 P DKNK 20 3 log2 N 3 log2 N
Kết luận: Ở quy mô phòng thí nghiệm, vaccine tái tổ hợp có khả năng tạo
Hình 3.23. Kết quả phản ứng HI đánh giá hàm lượng kháng thể kháng virus cúm A/H5N1
3.3.4.3. Kết quả phản ứng HI kiểm tra kháng thể kháng Newcastle
Các mẫu huyết thanh thu nhận từ gà tiêm phòng virus tái tổ hợp DKNK (LaSoTa tái tổ hợp mang gen H5) được sử dụng để kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng Newcastle và cúm A/H5N1. Các mẫu huyết thanh được lấy từ gà 3 tuần tuổi sau khi sử dụng virus tái tổ hợp DKNK lần 2. Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng Newcastle được thể hiện ở hình 3.24.
Hình 3.24. Kết quả phản ứng HI đánh giá hàm lượng kháng thể kháng Newcastle.
Kết quả kiểm tra HI: Trong 20 mẫu huyết thanh nghiên cứu có 17 mẫu đạt hiệu giá từ 4log2 đến 7log2 (chiếm 84%). Từ hiệu giá kháng thể 4log2 trở lên gà có khả năng bảo hộ đối với bệnh Newcastle.
Kết luận: Ở quy mô phòng thí nghiệm cho thấy vaccine LaSoTa tái tổ hợp có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch với Newcastle ở gà được tiêm phòng vaccine.
Từ các kết quả bước đầu về thử nghiệm đáp ứng miễn dịch trên gà, chúng tôi có nhận xét như sau:
- Giống virus tái tổ hợp DKNK sau khi tiếp truyền trên trứng gà SPF để giữ giống đã đảm bảo đầy đủ tính thích ứng trên phôi gà 10 ngày tuổi. Nước trứng thu được sau khi gây nhiễm phôi 72 giờ, đều có hiệu giá HA từ 1/64 - 1/128.
- Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy giống virus vaccine tái tổ hợp nghiên cứu đảm bảo các chỉ tiêu vô trùng, an toàn và hiệu lực; có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch với Newcastle và cúm A/H5N1 ở quy mô thử nghiệm phòng thí nghiệm.
KẾT QUẢ HỢP TÁC QUỐC TẾ VIỆT NAM - THÁI LAN
- Đã thực hiện thành công 6 đoàn ra và một đoàn vào để trao đổi khoa học, bàn kế hoạch hợp tác và thực hiện thí nghiệm. Mọi chi phí do phía Việt Nam chịu.
- Vấn đề khảo sát dịch tễ học phân tử mỗi bên thực hiện trên nguồn mẫu cúm A/H5N1 của mình, sau khi có kết quả họp trao đổi thông tin và một số chủng virus; ngoài ra phía Việt Nam cung cấp một số huyết thanh kháng H5N1 (vacxin NIBRG- 14 và thực địa) cho Thái Lan nghiên cứu.
- Vấn đề thiết kế biểu hiện kháng nguyên H5 do Việt Nam thực hiện.
- Giữa Việt Nam và Thái Lan hợp tác cùng nhau trong việc thiết kế plasmid vector LaSoTa và gắn gen H5 để tạo virus tái tổ hợp. Cụ thể công việc của mỗi bên như sau:
+ Chiến lược và phương pháp thí nghiệm do phía BIOTEC - Thái Lan chịu trách nhiệm chính, sau khi đã thống nhất với phía Việt Nam.
+ Các công việc thí nghiệm được thực hiện tại BIOTEC - Thái Lan. Hóa chất, cơ sở vật chất thực hiện thí nghiệm do BIOTEC cung cấp, plassmid chứa H5 và N1 của mẫu virus dòng Phúc Kiến do Việt Nam cung cấp. Cán bộ nghiên cứu thực hiện thí nghiệm do cả phía Thái Lan và phía Việt Nam cử người sang để cùng thực hiện. + Nguyên liệu: Chủng virus LaSoTa để thiết kế vector do phía Thái Lan cung cấp. Gen kháng nguyên HA (H5) dùng để gắn vào vector kiến tạo virus tái tổ hợp do phía Việt Nam cung cấp. Đây là chủng virus mới xuất hiện ở Việt Nam năm 2007 (giai đoạn đăng ký đề tài) thuộc dòng Phúc Kiến.
- Các kết quả hợp tác khác:
+ Phía Việt Nam học được các kỹ thuật và kinh nghiệm trong việc tạo vector tái tổ hợp mang cả hệ gen lớn.
+ Phía Việt Nam chia sẻ với Thái Lan các kinh nghiệm về nghiên cứu dịch tễ phân tử.
+ Tổ chức seminar tại BIOTEC - Thái Lan. Chi phí đi lại của phía Việt Nam do đề tài tài trợ.
+ Đã tập huấn thành công cho một cán bộ nghiên cứu của Việt Nam tại BIOTEC - Thái Lan (có chứng chỉ).
+ Đã tổ chức thành công Hội thảo khoa học Việt Nam - Thái Lan về cúm A/H5N1 tổ chức tại Hà Nội (Việt Nam). Mọi chi phí đi lại, ăn ở cho hai chuyên gia Thái Lan do phía Việt Nam đài thọ.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN
1. Nhiệm vụ nghị định thư đã thành công trong việc nghiên cứu dịch tễ phân tử của virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam giai đoạn 2004 - 2011 và đã lưu được các gen H5 và N1 trong plasmid để làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo trong tương lai. Sự tồn tại và lây nhiễm cúm A/H5N1 rất phức tạp. Các chủng virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam trong nghiên cứu thuộc 4 clade kháng nguyên là: clade 1; clade 1.1; clade 2.3.2.1 và clade 2.3.4.3. Trong đó, clade 2.3.2.1 là clade mới xuất hiện và đang được thế giới rất quan tâm. 2. Nhiệm vụ nghị định thư đã thành công trong việc tạo protein HA1 tái tổ hợp
của cúm A/H5N1 để sử dụng cho việc chẩn đoán. Protein tái tổ hợp này được sử dụng làm kháng nguyên cho kit phản ứng ELISA để kiểm tra phát hiện sớm kháng thể kháng H5N1 tại các vùng có nguy cơ nhiễm cao và có thể ứng dụng giám sát tiêm phòng vaccine tại Việt Nam.
3. Nhiệm vụ đã thành công trong việc thiết kế plasmid vector LaSoTa (pLST) và gắn gen H5 của cúm A/H5N1 dòng Phúc Kiến. Kết quả đã tạo được virus
tái tổ hợp giữa LaSoTa và H5N1 có đáp ứng miễn dịch với cúm A/H5N1 và Newcastle ở quy mô phòng thí nghiệm qua kiểm tra bằng hiệu giá HI.
4. Đã xây dựng được hai quy trình : Quy trình chế tạo kháng nguyên tái tổ hợp HA1 của virus cúm A/H5N1 và Quy trình tạo virus LaSoTa tái tổ hợp mang gen H5 làm giống virus vaccine.
5. Hợp tác Quốc tế Việt Nam - Thái Lan đã được tiến hành hiệu quả và thu được kết quả tốt đẹp. Kết quả hợp tác đã tạo được chủng virus tái tổ hợp có đáp ứng miễn dịch như yêu cầu của Nhiệm vụ. Đồng thời, hai bên đã trao đổi được các kỹ thuật mới cũng như các kinh nghiệm trong việc nghiên cứu virus cúm A/H5N1 ở mỗi nước.
ĐÁNH GIÁ CHUNG VỀ NHIỆM VỤ
1. Đề tài đã hoàn thành các nội dung đăng ký.
2. Đề tài đã có đầy đủ số lượng chủng loại sản phẩm đăng ký theo hợp đồng, trong đó có sản phẩm là gen H5 và N1 lưu giữ trong plasmid; đã xác định được các clade kháng nguyên ở Việt Nam; đã tạo được protein kháng nguyên HA1 tái tổ hợp để phục vụ cho việc chẩn đoán; đã tạo được giống virus tái tổ hợp, là kết quả của hợp tác nghiên cứu có hiệu quả với đối tác quốc tế là Viện Nghiên cứu công nghệ di truyền và công nghệ sinh học quốc gia Thái Lan.
3. Về thời gian thực hiện đề tài: Đề tài có thời gian thực hiện bị kéo dài so với đăng ký ban đầu do năm 2009 phía Thái Lan có biến động về chính trị, nên không thực hiện được việc hợp tác nghiên cứu khoa học, điều này có ảnh hưởng nhất định đến tiến độ thực hiện Nhiệm vụ nghị định thư.
4. Tiếp tục của đề tài, trong năm 2011, mặc dù không còn kinh phí, nhưng nhóm nghiên cứu của đề tài vẫn tiếp tục mở rộng công việc và đã thu được thêm những kết quả mới về dịch tễ học phân tử virus cúm A/H5N1 năm 2011 ở Việt Nam, đó là việc phát hiện clade kháng nguyên mới (clade 2.3.2.1 và clade 1.1) tại Việt Nam. Với kết quả này, nhóm nghiên cứu đã đăng 1 bài báo quốc gia và chuẩn bị một bài báo quốc tế đang trong giai đoạn phản biện.
ĐỀ NGHỊ
1. Cần giải mã gen H5 và N1 và toàn bộ hệ gen của một số chủng mới (clade 2.3.2.1 của năm 2011) để phân tích so sánh với các chủng cùng và khác nhóm kháng nguyên để có cơ sở dữ liệu đánh giá biến đổi di truyền cúm A/H5N1 hiện nay và định hướng vaccine phòng bệnh.
2. Các nguồn nguyên liệu gen bao gồm: chủng giống virus sống, các plasmid lưu giữ gen H5 và N1 của các chủng virus cúm mà chúng tôi thu nhận và lưu giữ có thể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo trong tương lai để sản xuất các chế phẩm thế hệ mới.
3. Kính đề nghị Bộ Khoa học và Công nghệ tạo điều kiện về đề tài và kinh phí để tiếp tục hoàn thiện và thử nghiệm đáp ứng miễn dịch của giống virus tái tổ hợp, cũng như nghiên cứu dịch tễ học phân tử cúm A/H5N1 giai đoạn mới với các nhóm kháng nguyên mới xuất hiện.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Lê Trần Bình (2007), Báo cáo tổng kết đề tài độc lập cấp nhà nước: “Nghiên cứu xây
dựng qui trình sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm” (2006-2007), Trung tâm
Thông tin và Tư liệu Quốc gia và Bộ Khoa học và Công nghệ, Hà Nội.
2. Lê Trần Bình, Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải,
Nguyễn Thị Bích Nga, Trương Nam Hải (2006), Phân tích mối tương đồng kháng
nguyên và miễn dịch của virus cúm A các chủng cường độc đương nhiễm và các
chủng vaccine cúm A/H5N1. Tạp chí Công nghệ Sinh học 4(3), tr.291-296.
3. Trương Văn Dung, Nguyễn Viết Không (2004), Một số hoạt động nghiên cứu khoa học
của Viện Thú y quốc gia về bệnh cúm gia cầm và giải pháp khoa học công nghệ trong
thời gian tới, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XI (3), tr.62-65.
4. Nguyễn Tiến Dũng, Malik Peiris, Robert Webster, Đào Thanh Vân, Bùi Ngọc Anh,
Nguyễn Thế Vinh, Kent Inui, Bùi Nghĩa Vượng, Nguyễn Viết Không và Ngô Thanh
Long (2004), Nguồn gốc virus cúm gia cầm H5N1 tại Việt Nam năm 2003-2004, Tạp
chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XI (3), tr.6-14.
5. Lê Thanh Hoà, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải,
Phạm Việt Cường, Nguyễn Thị Bích Nga, Lê Trần Bình (2008), Virus cúm A/H5N1:
Vấn đề dịch tễ học, tiến hoá, hình thành genotype và tương đồng kháng nguyên - miễn
dịch-vaccine. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6(4A), tr. 529-553.
6. Lê Thanh Hòa (2006a), Chiến lược nghiên cứu ứng dụng virus vector tái tổ hợp trong
sản xuất vaccine thế hệ mới, Tạp chí Công nghệ Sinh học 4(4), tr.397-416. Tổng quan.
7. Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, và
cộng sự (2005), Nghiên cứu sinh học phân tử các chủng virus cúm A/H5N1 phân lập ở
Việt Nam tại viện công nghệ sinh học, Hội nghị khoa học kỉ niệm 30 năm Viện Khoa
học và Công nghệ sinh học (19/05/2005), tr.75-82
8. Lê Quỳnh Mai (2011), Sự khác nhau về kiểu hình HA của virus cúm gia cầm độc lực
cao A/H5N1 gây bện cho người tại Việt Nam, Tạp chí Y học thực hành (764) 5, tr:73-
75).
9. Nguyễn Thị Lan Phương, Lê Văn Hiệp (2006), Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng
chống cúm A/H5N1 cho người trên phôi gà từ chủng NIBRG-14 tại Viện vaccine và
sinh phẩm y tế - Nha Trang, Tạp chí Y học dự phòng, 5(84), tr.5-10.
10.Cao Bảo Vân, Võ Hồ Hồng Hải, Ngô Thanh Long, Lê Hà Tầm Dương (2005), Đánh
giá về độc tính và khả năng lây cho người của virus cúm A/H5N1 qua các vụ dịch
2004-2005 tại miền Nam Việt Nam qua giám sát đột biến gen, Tạp chí Y học dự phòng,
16(6), tr.5-10.
TIẾNG ANH
11.Alexander D.J (2007), An overview of the epidemiology of avian influenza, Vaccine,
12.Arinaminpathy N, McLean A.R (2008), Antiviral treatment for the control of
pandemic influenza: some logistical constraints, J R Soc Interface, 5(22), pp. 545-553.
13.Bhatia A, Kast R.E (2007), How influenza’s neuraminidase promotes virulence and
creates localize lung mucosa immuno-deficiency, Cell Mol Biol Lett 12(1), pp.111-119.
14.Capua I, Alexander D.J (2008), Ecology, epidemiology and human health implications
of avian influenza viruses: why do we need to share genetic data? Zoonoses Public
Health, 55(1), pp.2-15.
15.Chen H (2009), H5N1 avian influenza in China, Sci China C Life Sci, Review, 52(5),
pp.419-427.
16.Chen L.M, Davis C.T, Zhou H, Cox N.J, Donis R.O (2008), Genetic compatibility and
virulence of reassortants derived from contemporary avian H5N1 and human H3N2
influenza A viruses, PLoS Pathog, 4(5), e1000072.
17.Colman P.M (1994), Influenza virus neuraminidase: structure, antibodies, and
inhibitors, Protein Sci 3(10), pp.1687-1696.
18.Conenello G.M, Zamarin D, Perrone L.A, Tumpey T, Palese P (2007), A single
mutation in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 influenza A viruses conibutes to
increased virulence, PLoS Pathog 3(10), pp.1414-1421.
19.Davis C.T, Balish A.L, O’Niell E, Nguyen C.V, Cox N.J, Xiyan X, Klimov A,
Nguyen T, Donis R.O (2010), Detection and characterization of clade 7 high pathogenicity avian influenza H5N1 viruses in chickens seized at ports of entry and
live pouly markets in Vietnam, Avian Dis,54(1 Suppl), pp.307-312.
20.De Jong M.D, Hien T.T (2006), Avian influenza A (H5N1), J Clin Virol, Review,
35(1), pp.2-13.
21.Duan L, Bahl J, Smith G.J, Wang J, Vijaykrishna D, Zhang L.J, Zhang J.X, Li K.S,
Fan X.H, Cheung C.L, Huang K, Poon L.L, Shoridge K.F, Webster R.G, Peiris J.S, Chen H, Guan Y (2008), The development and genetic diversity of H5N1 influenza
virus in China, 1996-2006, Virology, 380(2), pp.243-254.
22.FAOAIDEnews, 2011, Animal Influenza Disease Emergency, Stuation Update 80,
Bird flu Rears its Head Again:Increased Preparedness and Surveillance Urged Against Variant Strain.
23.Gong J, Xu W, Zhang J (2007), Structure and functions of influenza virus
neuraminidase, Curr Med Chem, 14(1), pp.113-122.
24.Guan Y, Shoridge K.F, Krauss S and Webster R.G (1999), Molecular characterization
of H9N2 influenza viruses: were they the donors of the “internal” genes of H5N1
viruses in Hong Kong? Proc Natl Acad Sci U S A, 96(16), pp.9363-9367
25.Horimoto T, Kawaoka Y (2006), Strategies for developing vaccines against H5N1
influenza A viruses, Trends Mol Med 12(11), pp.506-514. Review.
26.Hu X, Liu D, Wang M, Yang L, Wang M, Zhu Q, Li L, Gao G.F (2011), Clade 2.3.2
avian influenza virus (H5N1), Qinghai Lake region, China, 2009-2010. Emerg Infect
27.Hui D.S (2008), Review of clinical symptoms and spectrum in humans with influenza
A/H5N1 infection, Respirology,13 Suppl, S10-3.
28.Jadhao S.J, Nguyen D.C, Uyeki T.M, Shaw M, Maines T, Rowe T, Smith C, Huynh
L.P, Nghiem H.K, Nguyen D.H, Nguyen H.K, Nguyen H.H, Hoang L.T, Nguyen T, Phuong L.S, Klimov A, Tumpey T.M, Cox N.J, Donis R.O, Matsuoka Y, Katz J.M (2009), Genetic analysis of avian influenza A viruses isolated from domestic waterfowl in live-bird markets of Hanoi, Vietnam, preceding fatal H5N1 human
infections in 2004, Arch Virol, 154(8), pp.1249-1261.
29.Korteweg C, Gu J (2008), Pathology, molecular biology and pathogenesis of avian
influenza A (H5N1) infection in humans, Am J Pathol, Review, 172(5), pp.1155-1170.
30.Le Q.M, Ito M, Muramoto Y, Hoang P.V, Vuong C.D, Sakai-Tagawa Y, Kiso M,
Ozawa M, Takano R, Kawaoka Y (2010), Pathogenicity of highly pathogenic avian H5N1 influenza A viruses isolated from humans between 2003 and 2008 in northern
Vietnam, J Gen Virol, 91(10), pp.2485-2490.
31.Li Y, Liu L, Zhang Y, Duan Z, Tian G, Zeng X, Shi J, Zhang L, Chen H, (2011),