L ời cảm ơ n
3.3.3.1. Bố trí thí nghiệm
Giống virus LaSoTa tái tổ hợp (LaSoTa-H5) mang gen H5 (do Viện Công nghệ sinh học - Việt Nam phối hợp với Viện Công nghệ di truyền và Công nghệ sinh học Quốc gia Thái Lan sản xuất) được đặt tên là DKNK và được kiểm tra khả năng nhân lên ổn định trên phôi trứng gà bằng phản ứng HA.
Trứng gà sử dụng trong nghiên cứu là trứng gà sạch (SPF) được nhập từ Đức và trứng gà sạch của Trung tâm giống gia cầm Thụy Phương. Sau khi nhập về, trứng được ấp ở tủ ấm 37oC với đầy đủ các điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm. Hàng ngày soi trứng kiểm tra để giữ lại những trứng phát triển tốt và bỏ đi những trứng chết
Tiếp truyền lần 1 Tiếp truyền lần 2
1,7 kb 1,7 kb
hoặc kém phát triển. Phôi trứng gà 10 ngày tuổi được sử dụng để tiếp truyền giống virus. Sau khi tiếp truyền virus 96 giờ, mổ trứng để thu hoạch nước trứng.
Nước trứng thu nhận từ xoang niệu mô của phôi gà 96 giờ sau khi tiêm virus LaSoTa tái tổ hợp DKNK được sử dụng làm nguyên liệu để tiếp truyền virus trên phôi gà sạch tiêu chuẩn 10 ngày tuổi đời tiếp theo với mục đích để nhân hàm lượng virus tái tổ hợp và sản xuất một lượng lớn cho kiểm tra đáp ứng miễn dịch trên gà.
Hình 3.21. Hình ảnh ấp trứng và tiếp truyền virus tái tổ hợp.
3.3.3.2. Kết quả chuẩn độ virus tái tổ hợp – xác định liều gây nhiễm EID50 của giống virus DKDK
Việc xác định liều gây nhiễm EID50 của virus tái tổ hợp DKNK trong các lô giống là rất quan trọng. Trên cơ sở của liều gây nhiễm EID50, dựa vào chỉ tiêu này để đánh giá được độ ổn định của giống.
- Nước trứng chứa virus LaSoTa tái tổ hợp DKNK thu hoạch từ các lần tiếp truyền virus được pha loãng ở 12 nồng độ khác nhau từ 10-1 đến 10-8 (Chú ý: Việc pha loãng virus có ý nghĩa rất lớn trong việc chuẩn độ virus, nên phải thực hiện chính xác với các dụng cụ chuẩn và tuyệt đối vô khuẩn).
- Ở mỗi nồng độ pha loãng virus tiêm cho 8 phôi gà đạt tiêu chuẩn. Kết quả xác định liều gây nhiễm 50% trứng (EID50) của giống virus được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3: Xác định liều gây nhiễm 50% trên phôi trứng gà (EID50) của giống virus LaSoTa tái tổ hợp DKNK mang gen H5 của virus cúm A/H5N1
Số thực tế Số tính toán F Số trứng có HA dương tính I N i n i n i + Tỷ lệ % 10-1 8/8 8 0 40 0 40/40 100 10-2 8/8 8 0 32 0 32/32 100 10-3 7/8 7 1 24 1 24/25 87 10-4 6/8 6 2 17 3 17/20 75 10-5 5/8 5 3 11 6 11/17 62 10-6 3/8 3 5 6 11 6/17 37 10-7 2/8 2 6 3 17 3/20 25 10-8 1/8 1 7 1 24 1/25 12 Ghi chú:
F: Độ pha loãng virus
I: Số trứng có HA dương tính ở mỗi nồng độ N:Số trứng có HA âm tính ở mỗi nồng độ
i: Số trứng có HA dương tính cộng dồn từ dưới lên n: Số trứng có HA âm tính cộng dồn từ trên xuống
Công thức Reed & Muench:
F X B F X LogA
EID log log log
log 50= + 1 = + 2 , , , 1 50 B A A X − − = và 2 50, ,, B A B X − − = Trong đó: - A: Số mũ nồng độ có HA dương tính cận trên 50% - B: Số mũ nồng độ có HA dương tính cận dưới 50% - A/: Tỷ lệ phần trăm cận trên 50% - B/: Tỷ lệ phần trăm cận dưới 50%
Theo kết quả thí nghiệm ở Bảng 1, dựa vào công thức ta có: Log(EID50) = Log 10-5 + (50 - 62)/(62 - 37) x log10
= -5 + (-0,48) = - 5,48 = Log 10-5,48
EID50 = 10-5,48
Như vậy, giống DKNK sau tiếp truyền có liều gây nhiễm EID50 trên phôi gà là 10-5,48, có nghĩa là với độ pha loãng virus 10-5,48 khi tiêm cho trứng thì có khả năng
3.3.3.3. Kết quả kiểm tra vô trùng, an toàn của giống virus tái tổ hợp
a) Kết quả kiểm tra vô trùng của giống vaccine
Để kiểm tra đặc tính vô trùng của giống virus tái tổ hợp, chúng tôi đã thực hiện cấy 0,2 ml dịch nước trứng thu được vào các ống môi trường sau: Thạch máu; Nước thịt; Nước thịt gan yếm khí và Thạch nấm. Môi trường được giữ trong tủ ấm 370C trong 72 giờ. Kết quả cụ thể như sau: Kiểm tra vô trùng Lô vaccine Thạch máu Nước thịt Yếm khí Thạch nấm 1 - - - - 2 - - - - 3 - - - - 4 - - - - 5 - - - -
Kết quả cho thấy ở tất cả các ống môi trường đều không có vi khuẩn mọc. Từ đó kết luận: Giống virus tái tổ hợp thu được đảm bảo chỉ tiêu vô trùng.
b) Kết quả kiểm tra an toàn của giống vaccine
- Giống virus tái tổ hợp được kiểm tra an toàn bằng cách gây nhiễm trên phôi gà sạch 10 ngày tuổi với liều gấp hai lần liều tiêm bình thường (0,4 ml/quả).
Kiểm tra vô trùng Lô vaccine Sống 24 giờ (%) Sống 48 gi(%) ờ Sống 72 gi(%) ờ Sống 96 gi(%) ờ Sống 120 gi(%) ờ 1 100 100 100 100 100 2 100 100 100 100 100 3 100 100 100 100 100 4 100 100 100 100 100 5 100 100 100 100 100
- Giống virus tái tổ hợp sử dụng cho thí nghiệm là nước trứng thu được qua tiếp truyền trên phôi gà 10 ngày tuổi.
Qua ba lần lặp lại thí nghiệm, kết quả đều cho thấy 100% số trứng được tiêm sống sau 120 giờ. Từ kết quả thí nghiệm trên cho thấy giống virus tái tổ hợp đảm bảo tính an toàn tuyệt đối trên phôi gà.
3.3.3.4. Kiểm tra tính ổn định của giống virus tái tổ hợp
Virus tái tổ hợp DKNK mang gen H5 được tiếp truyền nhiều đời trên phôi gà 10 ngày tuổi và kiểm tra tính ổn định bằng phản ứng HA. Số lần kiểm tra: 2 đợt (ở hai lần tiếp truyền). Quy trình thực hiện phản ứng được trình bày ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4: Quy trình thực hiện phản ứng HA Số thứ tự các giếng Nguyên liệu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PBS (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 *Kháng
nguyên (µl) 25 Trộn và chuyển 25 µl từ giếng số 1 đến giếng số 12
PBS (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Độ pha
loãng 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 1/4096 Hồng cầu
gà 1% (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
Kết quả kiểm tra cho thấy ở cả hai đợt, giống virus tái tổ hợp kiểm tra đều có hiệu giá HA đạt từ 1/64 đến 1/128 (4log2 – 7log2), điều đó chứng tỏ virus tái tổ hợp nhân lên tốt trong môi trường nước trứng qua các lần tiếp truyền.
3.3.3.5. Kết quả kiểm tra virus tái tổ hợp chứa gen H5 bằng sinh học phân tử
Nước trứng thu được qua các lần tiếp truyền được tách chiết RNA tổng số, kiểm tra sự có mặt của virus LaSoTa và H5N1 bằng phản ứng RT-PCR, với các cặp mồi đặc hiệu của gen H5 (virus cúm A/H5N1) và gen F (virus Newcastle/LaSoTa).
4,4 kb 2,3 kb 2,0 kb 0,54 kb C B M 1 2 1,7 kb 2 kb 1.8 kb M 1 A B
Hình 3.22. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR mẫu virus LaSoTa tái tổ hợp DKNK.
Ghi chú: A. M: Chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể Lamda được cắt bằng HindIII. 1,
thực khuẩn thể Lamda được cắt bằng HindIII. 1: Sản phẩm RT-PCR gen F của virus LaSoTa (1,7 kb).
Kết quả khảo sát sinh học phân tử đã xác định là trong các mẫu nước trứng nghiên cứu có sự có mặt gen F của virus LaSoTa và gen H5 của virus cúm A/H5N1
(Hình 3.22). Từ đó chứng minh sự có mặt của virus LaSoTa và virus cúm A/H5N1
trong mẫu virus tái tổ hợp.
3.3.4. Kết quả kiểm tra hiệu lực và đáp ứng miễn dịch của giống virus vaccine tái tổ hợp
3.3.4.1. Bố trí thí nghiệm
Nước trứng chứa virus tái tổ hợp DKNK (LaSoTa tái tổ hợp mang gen H5) của cúm A/H5N1 được sử dụng như một chế phẩm cung cấp virus làm kháng nguyên để thử nghiệm đáp ứng miễn dịch trên gà ở quy mô hẹp ở phòng thí nghiệm. Cách bố trí thí nghiệm như sau:
- Gà được bố trí làm ba lô:
+ Lô 1: 20 con. Thử nghiệm virus tái tổ hợp DKNK -1 (tiếp truyền đợt 1) + Lô 2: 20 con. Thử nghiệm virus tái tổ hợp DKNK -2 (tiếp truyền đợt 2) + Lô 3: 10 con. Đối chứng, không sử dụng virus tái tổ hợp DKNK
- Phương thức đưa vaccine:
+ Virus tái tổ hợp DKNK được đưa vào cơ thể gà qua đường uống + Thời gian đưa virus tái tổ hợp DKNK: 2 lần.
- Lần thứ nhất: Gà 2 tuần tuổi - Lần thứ hai: Gà 3 tuần tuổi + Liều lượng: 0,3 ml/con
- Sau khi đưa vaccine lần thứ hai 3 tuần, tiến hành lấy máu thu huyết thanh để kiểm tra hàm lượng kháng thể Newcastle và cúm A/H5N1 trong tất cả gà sử dụng gây miễn dịch virus tái tổ hợp DKNK và gà đối chứng (không sử dụng virus tái tổ hợp DKNK) bằng phản ứng HI.
- Địa điểm thực hiện thí nghiệm: Trại thí nghiệm của Viện Công nghệ sinh học (Hà Nội).
- Gà trống khoẻ mạnh, trọng lượng khoảng 1,5 – 2 kg, chưa được tiêm vaccine H5N1và Newcastle được sử dụng để thu hồng cầu.
- Kháng nguyên chuẩn H5N1 (do Viện Thú y Trung ương cung cấp)
- Kháng nguyên Newcastle (do Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương cung cấp) - Huyết thanh gà được tiêm virus tái tổ hợp DKNK -1 và DKNK -2.
3.3.4.2. Kết quả phản ứng HI kiểm tra kháng thể kháng virus cúm A/H5N1
Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng virus cúm A/H5N1 được thể
hiện ở hình 3.23.
Trong tổng số 20 mẫu huyết thanh kiểm tra, số mẫu có hiệu giá kháng thểđạt từ 4log2 trở lên sau 3 tuần tiêm vaccine là 15 mẫu (chiếm 75%).
1 tuần sau tiêm vaccine 3 tuần sau tiêm vaccine Ký hiệu mẫu Kết quả HI
Đánh giá Kết quả HI Đánh giá
Pos 7 log2 P 7 log2 P Neg 0 log2 N 0 log2 N
DKNK1 4 log2 P 6 log2 P DKNK2 3 log2 N 5 log2 P DKNK3 4 log2 P 6 log2 P DKNK4 3 log2 N 4 log2 P DKNK5 5 log2 P 6 log2 P DKNK6 4 log2 P 5 log2 P DKNK7 2 log2 N 3 log2 N DKNK8 2 log2 N 2 log2 N DKNK 9 4 log2 P 4 log2 P DKNK 10 3 log2 N 3 log2 N DKNK 11 4 log2 P 5 log2 P DKNK 12 3 log2 N 5 log2 P DKNK 13 4 log2 P 5 log2 P DKNK 14 4 log2 P 5 log2 P DKNK 15 5 log2 P 6 log2 P DKNK 16 2 log2 N 3 log2 N DKNK 17 4 log2 P 4 log2 P DKNK 18 3 log2 N 4 log2 P DKNK 19 4 log2 P 5 log2 P DKNK 20 3 log2 N 3 log2 N
Kết luận: Ở quy mô phòng thí nghiệm, vaccine tái tổ hợp có khả năng tạo
Hình 3.23. Kết quả phản ứng HI đánh giá hàm lượng kháng thể kháng virus cúm A/H5N1
3.3.4.3. Kết quả phản ứng HI kiểm tra kháng thể kháng Newcastle
Các mẫu huyết thanh thu nhận từ gà tiêm phòng virus tái tổ hợp DKNK (LaSoTa tái tổ hợp mang gen H5) được sử dụng để kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng Newcastle và cúm A/H5N1. Các mẫu huyết thanh được lấy từ gà 3 tuần tuổi sau khi sử dụng virus tái tổ hợp DKNK lần 2. Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng Newcastle được thể hiện ở hình 3.24.
Hình 3.24. Kết quả phản ứng HI đánh giá hàm lượng kháng thể kháng Newcastle.
Kết quả kiểm tra HI: Trong 20 mẫu huyết thanh nghiên cứu có 17 mẫu đạt hiệu giá từ 4log2 đến 7log2 (chiếm 84%). Từ hiệu giá kháng thể 4log2 trở lên gà có khả năng bảo hộ đối với bệnh Newcastle.
Kết luận: Ở quy mô phòng thí nghiệm cho thấy vaccine LaSoTa tái tổ hợp có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch với Newcastle ở gà được tiêm phòng vaccine.
Từ các kết quả bước đầu về thử nghiệm đáp ứng miễn dịch trên gà, chúng tôi có nhận xét như sau:
- Giống virus tái tổ hợp DKNK sau khi tiếp truyền trên trứng gà SPF để giữ giống đã đảm bảo đầy đủ tính thích ứng trên phôi gà 10 ngày tuổi. Nước trứng thu được sau khi gây nhiễm phôi 72 giờ, đều có hiệu giá HA từ 1/64 - 1/128.
- Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy giống virus vaccine tái tổ hợp nghiên cứu đảm bảo các chỉ tiêu vô trùng, an toàn và hiệu lực; có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch với Newcastle và cúm A/H5N1 ở quy mô thử nghiệm phòng thí nghiệm.
KẾT QUẢ HỢP TÁC QUỐC TẾ VIỆT NAM - THÁI LAN
- Đã thực hiện thành công 6 đoàn ra và một đoàn vào để trao đổi khoa học, bàn kế hoạch hợp tác và thực hiện thí nghiệm. Mọi chi phí do phía Việt Nam chịu.
- Vấn đề khảo sát dịch tễ học phân tử mỗi bên thực hiện trên nguồn mẫu cúm A/H5N1 của mình, sau khi có kết quả họp trao đổi thông tin và một số chủng virus; ngoài ra phía Việt Nam cung cấp một số huyết thanh kháng H5N1 (vacxin NIBRG- 14 và thực địa) cho Thái Lan nghiên cứu.
- Vấn đề thiết kế biểu hiện kháng nguyên H5 do Việt Nam thực hiện.
- Giữa Việt Nam và Thái Lan hợp tác cùng nhau trong việc thiết kế plasmid vector LaSoTa và gắn gen H5 để tạo virus tái tổ hợp. Cụ thể công việc của mỗi bên như sau:
+ Chiến lược và phương pháp thí nghiệm do phía BIOTEC - Thái Lan chịu trách nhiệm chính, sau khi đã thống nhất với phía Việt Nam.
+ Các công việc thí nghiệm được thực hiện tại BIOTEC - Thái Lan. Hóa chất, cơ sở vật chất thực hiện thí nghiệm do BIOTEC cung cấp, plassmid chứa H5 và N1 của mẫu virus dòng Phúc Kiến do Việt Nam cung cấp. Cán bộ nghiên cứu thực hiện thí nghiệm do cả phía Thái Lan và phía Việt Nam cử người sang để cùng thực hiện. + Nguyên liệu: Chủng virus LaSoTa để thiết kế vector do phía Thái Lan cung cấp. Gen kháng nguyên HA (H5) dùng để gắn vào vector kiến tạo virus tái tổ hợp do phía Việt Nam cung cấp. Đây là chủng virus mới xuất hiện ở Việt Nam năm 2007 (giai đoạn đăng ký đề tài) thuộc dòng Phúc Kiến.
- Các kết quả hợp tác khác:
+ Phía Việt Nam học được các kỹ thuật và kinh nghiệm trong việc tạo vector tái tổ hợp mang cả hệ gen lớn.
+ Phía Việt Nam chia sẻ với Thái Lan các kinh nghiệm về nghiên cứu dịch tễ phân tử.
+ Tổ chức seminar tại BIOTEC - Thái Lan. Chi phí đi lại của phía Việt Nam do đề tài tài trợ.
+ Đã tập huấn thành công cho một cán bộ nghiên cứu của Việt Nam tại BIOTEC - Thái Lan (có chứng chỉ).
+ Đã tổ chức thành công Hội thảo khoa học Việt Nam - Thái Lan về cúm A/H5N1 tổ chức tại Hà Nội (Việt Nam). Mọi chi phí đi lại, ăn ở cho hai chuyên gia Thái Lan do phía Việt Nam đài thọ.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN
1. Nhiệm vụ nghị định thư đã thành công trong việc nghiên cứu dịch tễ phân tử của virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam giai đoạn 2004 - 2011 và đã lưu được các gen H5 và N1 trong plasmid để làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo trong tương lai. Sự tồn tại và lây nhiễm cúm A/H5N1 rất phức tạp. Các chủng virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam trong nghiên cứu thuộc 4 clade kháng nguyên là: clade 1; clade 1.1; clade 2.3.2.1 và clade 2.3.4.3. Trong đó, clade 2.3.2.1 là clade mới xuất hiện và đang được thế giới rất quan tâm. 2. Nhiệm vụ nghị định thư đã thành công trong việc tạo protein HA1 tái tổ hợp
của cúm A/H5N1 để sử dụng cho việc chẩn đoán. Protein tái tổ hợp này được sử dụng làm kháng nguyên cho kit phản ứng ELISA để kiểm tra phát hiện