L ời cảm ơ n
3.2.2.Kết quả biểu hiện gen HA1 trong tế bào E Coli
Với mục đích tạo được protein HA1 có khả năng sinh miễn dịch tốt, chúng tôi đã dung hợp gen HA1 với gen trx trong vector pET22trx để biểu hiện gen trong tế bào E. coli BL21. Gen HA1 trong vector được biểu hiện dưới sự điều khiển của T7 promoter và được điều hòa chặt chẽ bởi chất cảm ứng IPTG có trong môi trường.
Các dòng E. coli BL21 tái tổ hợp mang plasmid pET22trxha1 được nuôi cấy ở 37oC qua đêm trong 2 ml môi trường LBA (môi trường LB có chứa 100 µg/ml Ampicillin). Sau đó, tế bào được pha loãng trong môi trường LBA mới sao cho OD600 ≈ 0,1 và được nuôi tiếp ở cùng điều kiện trong khoảng thời gian 1,5 giờ để
1 2 3 4 5 M
pET22Trx
ha1 1 kb
OD600nm đạt từ 0,5 đến 0,8. Sau đó mẫu được cảm ứng bằng cách bổ sung IPTG đến nồng độ cuối cùng là 1 mM và lắc tiếp ở 30oC trong 4 giờ. Sau khi nuôi cấy cảm ứng, tế bào được thu lại và xử lý để kiểm tra protein tổng số của chúng. Kết quả điện di kiểm tra cho thấy, HA1 được biểu hiện dưới dạng protein lai với Trx có kích thước khoảng 57 kDa như tính toán (Hình 3.11). Điều đáng chú ý ở đây là protein tái tổ hợp được biểu hiện với hàm lượng khá lớn.
Hình 3.11. Protein tổng số từ các chủng tái tổ hợp E. coli BL21. 1: Thang protein chuẩn
(Fermentas); 2: E. coli BL21 mang vector pET22trx; 3-4: E. coli BL21 mang vector
pET22trxha1.
Hình 3.12. Xác định hàm lượng protein tái tổ hợp bằng phần mềm Quantitative one.
Kiểm tra sơ bộ khả năng tan của protein tái tổ hợp cho thấy khoảng 10% protein HA1 được tổng hợp ra dưới dạng tan, còn lại một lượng rất lớn protein
Trx 116 kDa 45 kDa 35 kDa 25 kDa 66 kDa TrxHA1 1 2 3 4
không tan. Khi kiểm tra ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng tan của protein thì thấy rằng ở nhiệt độ 22oC, HA1 được tổng hợp ra thấp nhất nhưng protein lại tan tốt nhất. Tuy nhiên, khi so sánh lượng protein tan thu được từ chủng được nuôi ở 22, 25, 30, 37oC, chúng tôi thấy rằng lượng protein tan thu được ở 25oC là cao nhất. Đồng thời, với nồng độ IPTG là 0,5 mM, lượng HA1 được tổng hợp ra cao hơn. Bằng phần mềm Quanlity One 4.6.3 (Bio-Rad, Mỹ), chúng tôi tính được lượng protein biểu hiện trong các điều kiện tối ưu đạt 15,47% so với protein tổng số (Hình 3.12).
3.2.3. Kết quả tinh chế TrxHa1 và nghiên cứu khả năng nhận biết TrxHA1 của kháng thểđa dòng kháng H5N1