L ời cảm ơ n
2.3.2.5. Phương pháp kiểm tra tính đặc hiệu kháng nguyên
Western blot
- Dung dịch và dụng cụ: dung dịch chuyển protein sang màng 10X (1000 ml, pH 8,3: 30 g Tris.Cl, 144,13 g glycine); dung dịch chuyển protein sang màng (1000 ml: 100 ml dung dịch chuyển màng 10X, 200 ml methanol 100%); dung dịch TBS 2X (500 ml: 25 ml Tris.Cl 1M, pH 7,5; 10 ml NaCl 5 M); dung dịch 1X TTBS (500 ml: 250 ml TBS 2X, 250 µl Tween 20); dung dịch sữa không béo 5% (5 g sữa không béo hòa trong 100 ml TBS 1X); dung dịch kháng thể 1: kháng thể 1 pha loãng ở nồng độ thích hợp (thường là 200X) bằng dung dịch sữa không béo 5%; dung dịch kháng thể 2 (kháng thể kháng IgG của gà gắn HPR (horseradish peroxidase) cung cấp bởi hãng Sigma được pha loãng 1:10000 bằng dung dịch sữa không béo); 30% H2O2 (Sigma, Mỹ); màng PVDF; dung dịch chất hiện màu (5 ml 100% methanol + 15 mg 4-chloro 1-napthol (Sigma, Mỹ) và 25 ml TBS 1X + 30 µl 30% H2O2).
- Cách tiến hành: Để tiến hành lai kháng nguyên, kháng thể bằng western blot, trước hết các kháng nguyên HA1 sau khi tinh chế được phân tách trên gel điện di polyacrylamide. Lượng kháng nguyên tái tổ hợp được đưa vào mỗi giếng là
khoảng 1 µg. Sau khi phân tách bằng điện di, protein trên gel được thấm chuyển sang màng PVDF với đệm chuyển màng 1X. Thứ tự đặt như sau: tấm xốp + giấy thấm + gel + màng + giấy thấm + xốp (tất cả được đặt trong một tấm kẹp). Trong đó màng PVDF được ngâm trước trong dung dịch methanol 100%, 10 phút và được ngâm trong đệm chuyển màng 1X lạnh. Quá trình chuyển màng được thực hiện ở 4oC được điều hòa bằng khuấy từ trong 2 giờ, hiệu điện thế 100 V cường độ dòng điện dao động 200 - 250 mA. Tháo bỏ tấm kẹp và lấy màng ra tráng vài lần bằng nước cất khử ion, sau đó chuyển màng vào dung dịch sữa không béo 5%, lắc qua đêm trong lạnh để phủ toàn bộ các vùng không có protein gắn vào. Lắc rửa màng trong dung dịch sữa không béo 10 phút, sau đó lắc rửa màng trong dung dịch 1X TTBS, 5 phút; lặp lại 3 lần. Màng được ngâm trong dung dịch kháng thể 1 là kháng thể gà kháng lại virus H5N1 và lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ. Rửa màng giống như mô tả ở trên. Sau đó, màng được ngâm với dung dịch kháng thể 2 là kháng thể kháng IgG của gà và lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ. Màng được rửa như đã mô tả ở trên. Sau đó, trộn các thành phần chất hiện màu với nhau và ngâm màng trong dung hiện màu trong vòng 10 phút. Phản ứng được dừng lại bằng cách rửa màng nhiều lần với nước khử ion, chụp ảnh bằng máy ảnh thông thường.