L ời cảm ơ n
3.2.1.Kết quả thu nhận gen HA1 và dòng hóa vào vector pET22trx
Protein HA là kháng nguyên bề mặt đặc trưng cho bản chất của từng chủng virus cúm A (Keawcharoen et al., 2005), có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình gây nhiễm và quyết định tính gây bệnh của virus.
Hiện nay, cúm A/H5N1 chủ yếu được xét nghiệm bằng phương pháp RT- PCR. Phương pháp này có độ nhạy cao, cho phép phát hiện nhiễm cúm ở giai đoạn rất sớm. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là mất thời gian và giá thành cao, không thực hiện được nhiều mẫu trong cùng một lúc. Vì thế, để giảm chi phí chẩn đoán thường sử dụng phương pháp chẩn đoán huyết thanh học. Hiện nay, để chẩn
2 kb 1,5 kb
1 kb 1 kb M 2
đoán H5N1 phương pháp sử dụng thông thường nhất là HA. Tuy nhiên, phương pháp này có độ nhạy không cao vì đòi hỏi phải có lượng lớn kháng nguyên, đồng thời trong phản ứng HA thì cả hai loại virus cúm A/H5N1 và Newcastle đều gây ngưng kết hồng cầu, gây khó khăn hơn trong việc chẩn đoán. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu, sản xuất tiểu phần HA1 của kháng nguyên hemagglutin dùng để tạo kit ELISA chẩn đoán nhanh sự có mặt của kháng thể kháng virus trong huyết thanh gia cầm ở giai đoạn sớm hơn. Điều này đặc biệt có ý nghĩa trong công tác dịch tễ điều tra sự nhiễm virus cúm A/H5N1 ở các vùng có nguy cơ cao. Chủng DkNA-114 được chọn để làm đối tượng nghiên cứu, chế tạo protein kháng nguyên tái tổ hợp. Đây là chủng virus cúm A/H5N1 thuộc dòng Phúc Kiến, là sản phẩm đăng ký của đề tài.
Bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu, gen HA1 đã được khuyếch đại thành công từ DNA khuôn là gen HA trong vector pCRH5 theo chu trình nhiệt thích hợp. Sản phẩm PCR trên gel là một băng đặc hiệu, có kích thước khoảng 1 kb đúng như kích thước của gen HA1 trên Ngân hàng gen (Hình 3.7). Gen HA1 sau đó được tách dòng trong vector pCR2.1 và được biến nạp vào tế bào E. coli
DH5α để tách dòng gen. Kết quả tách chiết kiểm tra sơ bộ vector pCRHA1 cho thấy các dòng này có kích thước lớn hơn kích thước vector pCR2.1 chứng tỏ gen HA1 đã được ghép nối vào vector (Hình 3.8).
Hình 3.7. Kết quảđiện di sản phẩm RT-PCR thu gen HA1
trên thạch agarose 1%. M. Băng DNA chuẩn (Fermentas). 1. Sản phẩm RT-PCR gen HA1
2,3 Kb 1 2 3 4 5 6 1,5 Kb 2,5 Kb 1 Kb 1,6 Kb ha1
Hình 3.8. Điện di kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp trên gen agarose 1%. 1. Plasmid đối
chứng (PCR2.1); 2-5: plasmid tái tổ hợp gắn gen HA1.
Gen HA1 trong vector tách dòng còn được kiểm tra bằng enzyme hạn chế
BamHI và NcoI (Hình 3.9). Sau khi đã chọn được dòng mang gen, chúng tôi đã chọn ra một dòng để giải trình tự gen. Sau khi đưa vào vector biểu hiện pET22trx, gen HA1 được kiểm tra bằng một số enzyme hạn chế. Dòng plasmid pET22trx mang đúng gen HA1 được đặt tên là pET22trxha1. Plasmid tái tổ hợp này được biến nạp vào chủng E. coli BL21 để biểu hiện gen.
Hình 3.9. Phân tích sản phẩm cắt các plasmid tái tổ hợp pCRha1 bằng enzyme NcoI và
BamHI. 1: Thang DNA chuẩn 1 kb (Fermentas); 2: Dòng pCR2.1 đối chứng; 3-6: Các
dòng pCRha1 cắt bằng enzym NcoI và BamHI
1 2 3 4 5
Hình 3.10. Kết quả cắt kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp (pET22Trxha1) bằng enzym cắt
hạn chếNcoI và BamHI. 1: plasmid pET22Trx (Đối chứng); 2-5: plasmid pET22Trxha1; 6:
Thang ADN chuẩn 1 kb (Fermentas).
Sau khi chọn được dòng pCRha1 đúng, chúng tôi tiến hành cắt gen HA1 ra khỏi vector tách dòng bằng cặp enzyme NcoI+BamHI và nối vào vector pET22trx cũng đã được xử lý bằng cặp enzyme trên. Sản phẩm sau khi lai được biến nạp vào tế bào tế bào E. coli DH5α để chọn dòng gen. Chúng tôi cũng tách chiết DNA plasmid từ các dòng tái tổ hợp và tiến hành điện di kiểm tra sơ bộ kích thước plasmid. Sau đó, các plasmid có kích thước lớn hơn plasmid pET22trx được cắt kiểm tra bằng cặp enzyme NcoI+BamHI. Kết quả điện di được trình bày ở hình 3.10.
Kết quả hình 3.10 cho thấy, gen HA1 đã được nối thành công vào vector pET22trx. Vector này được biến nạp vào tế bào E. coli BL21 để biểu hiện gen.