6. Bố cục luận văn
1.5. ỨNG DỤNG SINH HỌC CỦA MNPs
Hạt nano từ tính ứng dụng trong y sinh phải thỏa mãn 3 điều kiện sau: -Tính đồng nhất của các hạt cao.
-Từ độ bão hòa lớn.
-Vật liệu có tính tƣơng thích sinh học (không độc hại).
Tính đồng nhất về kích thƣớc và tính chất liên quan nhiều đến phƣơng pháp chế tạo còn độ từ ão hòa và tính tƣơng thích sinh học thì liên quan đến bản chất của vật liệu. Trong tự nhiên, sắt có từ độ bão hòa lớn nhất ở nhiệt độ phòng không độc đối với cơ thể con ngƣời và tính ổn định khi làm việc trong môi trƣờng không khí nên các vật liệu nhƣ oxit sắt Fe3O4 đƣợc nghiên cứu rất nhiều để làm hạt nano từ tính.
Các ứng dụng của hạt nano từ trong y sinh học đƣợc chia làm hai loại: ứng dụng ngoài cơ thể và trong cơ thể. Phân tách và chọn lọc tế ào là ứng dụng ngoài cơ thể nhằm tách những tế ào cần nghiên cứu ra khỏi các tế ào
khác. Các ứng dụng trong cơ thể gồm: dẫn truyền thuốc nung nóng thân nhiệt cục ộ và tăng độ tƣơng phản trong ảnh cộng hƣởng từ [4].
a. Phân tách và chọn lọc tế bào
Quá trình phân tách chia làm 2 giai đoạn: đánh dấu thực thể sinh học cần nghiên cứu và tách các thực thể đƣợc đánh dấu ra ngoài môi trƣờng ằng từ trƣờng. Việc đánh dấu đƣợc thực hiện thông qua các hạt nano từ tính thƣờng dùng là nano oxit sắt. Các hạt này đƣợc ao phủ ởi một loại hợp chất có tính tƣơng thích sinh học nhƣ: dextran polivinyl ancohol … Các hợp chất ao phủ có thể tạo liên kết ở một vị trí nào đó trên ề mặt tế ào hoặc phân tử cần tách gọi là tế ào hoặc phân tử đƣợc đánh dấu. Quá trình phân tách đƣợc thực hiện nhờ một gradien từ trƣờng ngoàitạo ra lực hút các hạt từ tính mang tế ào đƣợc đánh dấu. Các tế ào không đƣợc đánh dấu sẽ không ị giữ lại và đi ra ngoài. Cơ chế phân tách tế ào ằng từ trƣờng đƣợc trình ày ở hình 1.6.
Hình 1.6. Nguyên tắc phân tách tế bào bằng từ trường
Tách tế ào ằng từ trƣờng đã đƣợc ứng dụng thành công trong y sinh. Đây là một trong những phƣơng pháp rất nhạy cảm để tách tế ào ung thƣ trong máu đặc iệt khi tế ào ung thƣ rất thấp khó có thể tìm thấy ằng các phƣơng pháp khác.
b. Dẫn truyền thuốc
Do có tính tƣơng hợp sinh học cao nên các hạt MNP oxit sắt (magnetite Fe3O4 hematite α-Fe2O3) đƣợc sử dụng nhƣ là chất mang thuốc đến vị trí cần thiết trên cơ thể. Nguyên lý dẫn truyền thuốc đƣợc trình ày ở hình 1.7.
Thông thƣờng phƣơng pháp này đƣợc dùng để điều trị các khối u ung thƣ. Phƣơng pháp này có 2 lợi ích cơ ản: (i) thu hẹp phạm vi phân ố thuốc trong cơ thể nên làm giảm tác dụng phụ của thuốc; (ii) giảm lƣợng thuốc và tăng cƣờng hiệu quả điều trị.
Hình 1.7. Nguyên lí dẫn truyền thuốc dùng hạt nano từ tính
Nghiên cứu dẫn truyền thuốc đã đƣợc thử nghiệm rất thành công trên động vật đặc biệt là dùng để điều trị u não. Đến nay ngƣời ta đã thành công trong việc định hƣớng thuốc doxoru icin đến tế ào u ƣớu đƣợc cấy ở đuôi chuột. Phƣơng pháp này đã đƣợc mở rộng sang một số loại động vật khác và cũng cho kết quả tƣơng tự. Việc ứng dụng phƣơng pháp này trên ngƣời còn nhiều hạn chế nhƣng các kết quả nghiên cứu an đầu là rất khả quan.
c. Tăng nhiệt cục bộ
Phƣơng pháp đốt các tế bào ung thƣ bằng từ trƣờng ngoài mà không ảnh hƣởng đến các tế bào bình thƣờng là một trong những ứng dụng quan trọng khác của hạt nano từ tính. Một trong những nghiên cứu đầu tiên về đốt nhiệt từ xuất hiện từ năm 1957. Nguyên tắc hoạt động là các hạt nano từ tính có kích thƣớc từ 20-100 nm đƣợc phân tán trong các mô mong muốn, sau đó
tác dụng một từ trƣờng xoay chiều với tần số 1.2 MHz ên ngoài đủ lớn về cƣờng độ và tần số để làm cho các hạt nanô cộng hƣởng để tạo ra nhiệt nung nóng những vùng xung quanh. Nhiệt độ khoảng 42oC trong khoảng 30 phút có thể đủ để giết chết các tế bào ung thƣ trong khi các tế bào thƣờng vẫn an toàn [23].
Nghiên cứu về kĩ thuật tăng thân nhiệt cục bộ đƣợc phát triển từ rất lâu và có rất nhiều công trình đề cập đến kĩ thuật này nhƣng chƣa có công bố nào thành công trên ngƣời. Khó khăn chủ yếu đó là việc dẫn truyền lƣợng hạt nano phù hợp để tạo ra đủ nhiệt lƣợng khi có sự có mặt của từ trƣờng ngoài mạnh trong phạm vi điều trị cho phép. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nung nóng cục bộ là lƣu lƣợng máu và phân bố của các mô.
Vật liệu dùng để làm hạt nano thƣờng là magnetite và maghemite và có thể có tính sắt từ hoặc siêu thuận từ.
d. Tăng độ tương phản cho ảnh cộng hưởng từ
Hạt nano oxit sắt đƣợc bao phủ dextran có tính tƣơng hợp sinh học và có thể đƣợc đào thải qua gan sau khi sử dụng. Các hạt nano này đƣợc phát hiện bởi màng lƣới nội mô của cơ thể. Độ tƣơng phản trong ảnh cộng hƣởng từ hạt nhân dựa trên hiện tƣợng các mô khác nhau sẽ hấp thu khác nhau. Ví dụ các hạt nanô có đƣờng kính 30 nm có thể nhanh chóng đi vào gan và tì trong khi những cơ quan khác thì chậm hơn. Nhƣ vậy, mật độ hạt nano ở các cơ quan là khác nhau, dẫn đến sự nhiễu loạn từ trƣờng cục bộ cũng khác nhau làm tăng độ tƣơng phản trong ảnh cộng hƣởng từ do thời gian hồi phục bị thay đổi khi đi từ mô này đến mô khác. Những hạt có kích thƣớc nhỏ sẽ có thời gian tồn tại trong cơ thể lâu hơn vì màng lƣới nội mô nhận biết chúng khó hơn. Các hạt nano nhƣ là một chất tƣơng phản MRI có thể đi đến tủy xƣơng, mạch máu, hệ thần kinh. Màng lƣới nội mô của các tế bào ung thƣ hoạt động không hiệu quả nhƣ các tế bào khỏe mạnh thông thƣờng. Do đó thời gian hồi phục
của các proton trong các tế bào ung không bị ảnh hƣởng nhiều. Dựa trên điều này ngƣời ta xác định đƣợc các hạch bạch huyết, ung thƣ gan và ung thƣ não.
e. Cảm biến sinh học
Các hạt MNP oxit sắt có thể đƣợc sử dụng để phát triển hệ cảm biến sinh học. Ở kĩ thuật này ngƣời ta có thể gắn các hạt nano từ tính lên các phân tử nhận dạng sau đó cho các phân tử này tƣơng tác với phân tử cần phân tích đƣợc lƣu trên ề mặt cảm biến. Bằng việc đo từ tính phát ra từ các phân tử nhận dạng ngƣời ta có thể gián tiếp định tính hoặc định lƣợng các phân tử sinh học. Cơ chế cảm biến xác định antigen theo phƣơng pháp ―sandwich‖ đƣợc mô tả ở hình 1.8.
Hình 1.8. Cơ chế xác định protein dựa vào cảm biến từ. (a) Antibody được cố định trên bề mặt cảm biến, (b) Tương tác chọn lọc giữa antibody và antigen,
(c) Tương tác với antibody có gắn nhãn từ tính tạo cấu trúc “sandwich”, (d) Cấu trúc “sandwich” phát ra từ trường.
1.5.2. Ứng dụng trong xử lý môi trƣờng
Nano từ lỏng đƣợc ứng dụng để xử lý nƣớc bị nhiễm bẩn. Có nhiều phƣơng pháp vật lý, hóa học đƣợc sử dụng để xử lý nƣớc bẩn. Các phƣơng pháp này thƣờng phức tạp, tốn kém, mất nhiều thời gian nhƣng đôi khi hiệu quả không cao, không tách lọc triệt để các tạp chất trong nƣớc bẩn. Gần đây với việc chế tạo ra chất lỏng từ ferit ứng dụng để lắng đọng nƣớc bẩn bằng cơ chế tĩnh điện và hấp phụ, có thể làm sạch nƣớc triệt để, nhanh chóng, hiệu quả [3].
Mới đây một nhà khoa học Nhật Bản có sáng kiến sử dụng hạt nano từ tính lọc nƣớc bằng cách cho một loài vi khuẩn chuyên ăn các chất bẩn lơ lửng trong nƣớc bẩn có hòa tan bổ sung thêm các hạt nano từ tính. Bình thƣờng, các vi khuẩn có tác dụng thu gom các chất bẩn. Khi đã ăn no chúng tự chìm xuống đáy (theo tác dụng của trọng lực) và mang theo các chất bẩn đã thu gom. Do vậy làm cho nƣớc trở nên trong. Nếu trong nƣớc có các hạt nano từ tính thì các vi khuẩn sẽ gom vào mình các chất bẩn thông thƣờng và cả hạt nano từ tính. Khi đó có thể dùng một nam châm hút các vi khuẩn này làm cho chúng chìm nhanh hơn và nƣớc sẽ trong nhanh hơn.
Xuất phát từ ý tƣởng đó các nhà khoa học nƣớc ta đã kết hợp sử dụng nano từ tính Fe3O4 với Al2(SO4)3 để lọc nƣớc. Al2(SO4)3 khi tan trong nƣớc sẽ thủy phân tạo ra tạo ra kết tủa Al(OH)3 dạng keo. Kết tủa này có tác dụng nhƣ một tấm lƣới. Khi nó lắng đọng thì các chất bẩn mắc vào nó cũng ị kéo theo xuống, kết quả là nƣớc trong hơn. Khi đã kết hợp hạt nano từ tính Fe3O4 với Al(OH)3 dƣới tác dụng của từ trƣờng các hạt nano từ tính Fe3O4 bị hút xuống dƣới đồng thời kéo theo tấm lƣới Al(OH)3 chuyển động theo. Khi đó Al(OH)3 sẽ lắng động nhanh hơn hàng chục lần so với khi không dùng hạt nano từ tính.
1.5.3. Chất mang xúc tác
Sử dụng các hạt nano từ tính làm chất mang enzyme cho các ứng dụng trong xúc tác sinh học, y sinh là vấn đề đáng đƣợc quan tâm triển khai nghiên cứu khi kĩ thuật này vẫn chƣa đƣợc phát triển hoàn chỉnh, ngay cả trên thế giới lẫn trong nƣớc. Hệ xúc tác MNP-enzyme thể hiện nhiều ƣu điểm nổi bậc so với xúc tác enzyme tự do thông thƣờng trong các ứng dụng công nghệ sinh học do tính hiệu quả xúc tác cao, thời gian hoạt động đƣợc kéo dài, giới hạn chịu đựng cao, khó bị biến tính. Ngoài ra, tính chất từ của vật liệu xúc tác của hệ MNP-enzyme cho phép dễ dàng tách loại chúng ra khỏi hỗn hợp sản phẩm;
điều này là rất cần thiết cho các ứng dụng liên quan đến công nghệ sản xuất dƣợc phẩm do sự tồn lƣu của enzyme trong sản phẩm cuối sẽ gây nhiều tác dụng phụ bất lợi.
1.6. GIỚI THIỆU VỀ ENZYME 1.6.1. Khái quát về enzyme 1.6.1. Khái quát về enzyme
Enzyme là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học với mức độ đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tƣơng đối thấp. Enzyme có trong tất cả các tế bào sống, là các chất xúc tác sinh học. Nó có đầy đủ tính chất của chất xúc tác nhƣng enzyme có hiệu suất xúc tác lớn hơn tất cả các chất xúc tác hữu cơ và vô cơ khác.
Dựa vào kiểu phản ứng mà enzyme xúc tác ngƣời ta phân ra thành 6 lớp chính:
- Oxydoreductase: nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa - khử. - Transferase: nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị.
- Hydrolase: nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân.
- Lyase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần nƣớc, hoặc loại nƣớc tạo thành nối đôi hoặc kết hợp phân tử nƣớc vào nối đôi.
- Isomerase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa.
- Ligase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu năng lƣợng ATP …
1.6.2. Cơ chế xúc tác của enzyme
Quá trình xúc tác của enzyme xảy ra qua 3 giai đoạn:
E + S → ES→ E + P
E – Enzyme (enzyme) S – Cơ chất (substrate) P – Sản phẩm (products) - Giai đoạn thứ nhất: Enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu, nhờ đó sẽ tạo ra phức hệ enzyme – cơ chất.
- Giai đoạn thứ hai: Khi cơ chất tạo phức với enzyme, chúng sẽ bị thay đổi cả cấu hình không gian, lẫn mức độ bền vững của các liên kết. Kết quả là các liên kết bị cũ phá vỡ và tạo ra sản phẩm.
- Giai đoạn thứ a: Đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm quá trình phản ứng đƣợc tạo thành và tách ra khỏi enzyme.
1.7. ENZYME LIPASE
1.7.1. Giới thiệu về enzyme lipase
Lipase (E.C. 3.1.1.3) là một họ các enzyme mà trong môi trƣờng tự nhiên chúng xúc tác cho các phản ứng thủy phân chất éo đƣợc ứng dụng chủ yếu để xúc tác thủy phân acylglyceride hoặc một số este khác nhƣ thiol polyol hay polyaxit este [6]. Ngoài ra, lipase còn có thể đƣợc sử dụng làm chất xúc tác trong các phản ứng tổng hợp các acylglyceride hay este có giá trị ứng dụng cao trong đời sống. Lipase có bản chất là một globulin và có thể đƣợc sản xuất từ tuyến tụy và màng dạ dày của động vật. Tuy nhiên, sinh tổng hợp lipase từ vi sinh vật mang lại độ thuần khiết và hiệu suất cao hơn. Hiện tại ngƣời ta ứng dụng rộng rãi lipase trong công nghiệp dƣợc phẩm, hóa mỹ phẩm, dệt da, chất tẩy rửa, thực phẩm hoặc tổng hợp các chất hữu cơ khác nhiên liệu sinh học (bio-fuel).
1.7.2. Nguồn thu nhận enzyme lipase
a. Từ động vật
Lipase thu nhận từ những cơ quan mô của một số loài động vật hữu nhũ đã đƣợc nghiên cứu rất nhiều, nhƣng toàn diện hơn cả là lipase có nguồn gốc từ con ngƣời và một số lipase từ tuyến tụy.
b. Từ thực vật
Lipase từ thực vật không đƣợc chú ý nhiều so với những nguồn thu nhận khác. Tuy nhiên, gần đây loại enzyme này đã ắt đẩu đƣợc quan tâm và nghiên cứu khá phổ biến. Trong đó lipase từ những hạt có dầu là đƣợc quan
tâm nhất. Những enzyme này nếu thu nhận từ nguồn nguyên liệu khác nhau thì tính đặc hiệu về cơ chất, pH tối ƣu tính kỵ nƣớc cũng khác nhau. Những enzyme này có quan hệ mật thiết với triaxylglycerol có trong bản thân hạt dầu đó và chỉ đƣợc tổng hợp trong quá trình nảy mầm của hạt [24].
c. Từ vi sinh vật
Vi sinh vật có khả năng tổng hợp một lƣợng enzyme rất lớn trong một khoảng thời gian ngắn; hoạt tính của enzyme cao hơn hoạt tính của enzyme đƣợc tổng hợp từ động vật và thực vật. Lipase đƣợc thu nhận từ vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm men và nấm mốc.
1.7.3. Đặc điểm của lipase
a. Cấu trúc
Lipase có cấu trúc α - β với vị trí trung tâm là lƣới hỗn hợp β chứa bộ ba xúc tác và có cấu trúc xoắn ngăn cản cơ chất tiếp xúc trung tâm hoạt động(hình 1.9).
Cấu trúc của lipase Rhizomucor miehei là cấu trúc dạng α - β gồm vùng lƣới β trung tâm có tám dải β liên kết song song cuộn lên trên vùng xoắn lƣỡng cực (N-terminal). Ba liên kết disunfit trong phân tử lipase, Cys29-Cys268;
Cys40-Cys43 và Cys235-Cys244 có tác dụng làm cho toàn bộ cấu trúc của enzyme đƣợc ổn định. Vùng trung tâm hoạt động của enzyme có chứa bộ ba xúc tác Scrl44 His257 và Asp203 nhƣng lại bị che phủ bởi phần không phân cực của cấu trúc xoắn lƣỡng cực ―Lid‖. ―Lid‖ là một đoạn oligopeptit kỵ nƣớc mà enzyme esterase không có [29]. Chính vì điều này đã giúp lipase hấp phụ đƣợc trên bề mặt phân chia pha dầu-nƣớc và sau đó diễn ra sự tái sắp xếp cấu trúc enzyme .
Hình 1.9. Cấu trúc của enzyme lipase Candium
Lipase từ Geotrichum candidum cũng tồn tại dƣới hai dạng đồng phân: dạng I(pI=4,56) và dạng II (pII= 4,46) có từ hai đến ba vị trí N-glycosylalion tƣơng ứng với từng dạng dồng phân. Cấu trúc của enzyme cũng có dạng α/β với lƣới hỗn hợp β hình thành ởi 11 dải trong đó có 7 dải song song với nhau. Những cấu trúc cuộn xoắn liên kết với các dải đều nằm ở hai bên vùng lƣới β. Hai liên kết disulfide đƣợc tìm thấy là Cys61-Cysl05 và Cys276- Cys288.Bộ ba xúc tác là Ser217, His463 và Glu354 nằm trong vùng trung tâm hoạt động bị che khuất bởi hai cấu trúc xoắn α gần nhƣ song song với nhau.
b. Hoạt tính bề mặt
Nhờ vào kỹ thuật X quang mà cấu trúc tinh thể của một số lipase đã đƣợc xác định. Chúng ta biết rằng trong cấu trúc đó có một phân đoạn xoắn α đƣợc gọi là ―lid‖ đã che lấp trung tâm hoạt động làm cho enzyme không thể