6. Bố cục luận văn
1.8.2. Kĩ thuật cố định enzyme trên chất mang nano
a. Cố định enzyme bằng phương pháp vật lý
Cố định enzyme ằng phƣơng pháp vật lý có thể đƣợc xem là phƣơng pháp đơn giản nhất. Phƣơng pháp này có thể thực hiện dễ dàng ằng cách nhúng chất mang vào trong dung dịch có chứa enzyme mà không cần đƣa thêm tác nhân gắn kết nào vào dung dịch chứa enzyme hoặc phải xử lý ề mặt chất mang hay iến tính protein [25]. Nhiều nghiên cứu cố định enzyme lên ề mặt MNP oxit sắt đã đƣợc thực hiện ằng phƣơng pháp vật lý nhƣ enzyme glucose oxidase đƣợc cố định lên các hạt nano từ tính Fe3O4 ằng phƣơng pháp vật lý để khử oxy trong nƣớc; và hiệu suất cố định đạt đƣợc là 78% với hoạt độ riêng của enzyme cố định là 640 UI/g [17] . Ở một trƣờng hợp khác enzyme pectinase đã đƣợc cố định trên ề mặt hạt nano tích điện
âm AOT-Fe3O4và hoạt độ riêng cực đại của enzyme sau cố định đạt đƣợc là (1,98 UI/mgenzyme) với hiệu suất cố định đạt đƣợc là 610,5 mg enzyme/g chất mang; hoạt tính của enzyme cố định chỉ mất đi 10 -20% sau 6 chu kỳ xúc tác. Mặc dù phƣơng pháp cố định vật lý là đơn giản và có thể thực hiện ở điều kiện êm dịu ằng các liên kết yếu nhƣ liên kết hydro lực Van der Waals. Phƣơng pháp này thƣờng liên quan đến sự tƣơng tác tƣơng đối yếu nhƣ tƣơng tác kỵ nƣớc; độ ổn định của enzyme cố định chịu ảnh hƣởng mạnh ởi các điều kiện môi trƣờng ên ngoài nhƣ pH nhiệt độ lực ion, nồng độ phân tử sinh học... Vì vậy enzyme đƣợc cố định ằng phƣơng pháp vật lý có khuynh hƣớng dễ dàng ị tách khỏi chất mang dẫn đến việc mất hoạt tính và gây tạp nhiễm hỗn hợp sản phẩm phản ứng; điều này đã ảnh hƣởng đến khả năng tái sử dụng cũng nhƣ độ hoạt động cho enzyme cố định đặc iệt đối với các enzyme cố định của hệ cảm iến. Hơn nữa enzyme cố định ằng phƣơng pháp vật lý thƣờng ị iến tính hoặc giảm hoạt tính do sự thay đổi về cấu dạng dạng gây ra ởi tƣơng tác không gian.
b. Cố định bằng liên kết cộng hóa trị
Cố định bằng liên kết cộng hóa trị là phƣơng pháp có nhiều ƣu điểm do có thể hiệu chỉnh các nhóm chức đặc hiệu để gắn kết với enzyme. Cho đến nay, nhiều quy trình cố định enzyme bằng liên kết cộng hóa trị đã đƣợc xây dựng và sử dụng rộng rãi để cố định enzyme [20].
Các tác nhân gắn kết nhƣ glutaraldehyde (GA)và 1-ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl) car odiimide hydrochloride (EDC) thƣờng đƣợc sử dụng để gắn kết cộng hóa trị với các MNP bởi vì các nhóm chức của chúng (ví dụ: nhóm chức andehit) có thể tƣơng tác với cả nhóm chức trên bề mặt của các hạt MNP đã iến tính và enzyme. Ví dụ enzyme glucose oxidase (GOD) đƣợc cố định trên CoFe2O4/SiO2NPs thông qua liên kết chéo hóa glutaraldehyde. Sau khi cố định, GOD có sự cải thiện về độ bền nhiệt, có thể
lƣu trữ trong thời gian dài hơn mà hoạt tính của enzyme không bị mất đi. Enzyme GOD sau cố định vẫn duy trì đƣợc 80% hoạt tính an đầu. Sau khi lƣu giữ ở 4°C trong 28 ngày, hoạt tính của enzyme cố định và enzyme tự do vẫn còn 87% hoạt tính an đầu tƣơng ứng. Ở ví dụ khác, các hạt nano Fe3O4– chitosan đƣợc sử dụng để cố định lipase với tác nhân gắn kết là N-(3- dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide (EDC) và N-hydroxysuccinimide (NHS); điều kiện tối ƣu để có định đƣợc xác định nhƣ sau: Thời gian cố định 2,14 giờ; pH 6,37; tỉ lệ về khối lƣợng giữa enzyme/chất mang 0,73; hoạt tính cao nhất nhận đƣợc là 20 UI/g Fe3O4–chitosan. Enzyme cố định lypase duy trì đƣợc hơn 83% hoạt tính an đầu của nó sau 20 chu kỳ xúc tác. Mặc dầu vậy, trong nhiều trƣờng hợp, sự có mặt của tác nhân gắn kết có thể gây ra sự thay đổi cấu dạng của protein, dẫn đến làm giảm hoạt tính xúc tác của enzyme.
Một số enzyme khác cũng đƣợc cố định thành công trên các hạt MNP oxit sắt ằng liên kết cộng hóa trị nhƣ: lipase, Candida rugosa lipase, peroxidase, pectinase, trypsin, α-chymotrypsin, glucose oxidase, chitosanase, triacylglycerol lipase, .. .
Tuy nhiên phƣơng pháp gắn kết enzyme ằng liên kết cộng hóa trị cũng có những nhƣợc điểm nhƣ sự cạnh tranh giữa enzyme và tạp chất để gắn kết trên ề mặt chất mang nên ảnh hƣởng đến hiệu suất cố định enzyme; muốn loại ỏ điều này cần phải tốn thời gian và các nguồn vật lực cần thiết khác để tinh chế enzyme trƣớc khi cố định. Một vấn đề nữa liên quan đến cố định ằng liên kết cộng hóa trị là sự suy giảm hoạt tính của enzyme cố định việc loại ỏ enzyme cũng loại ỏ luôn hẳn chất mang vì gắn kết giữa enzyme và chất mang đƣợc hình thành từ liên kết cộng hóa trị ền vững.
c. Cố định bằng tác nhân sinh học trung gian
Cho đến nay đã có rất nhiều ứng dụng của enzyme cố định ằng phƣơng pháp gắn kết ngẫu nhiên trên ề mặt chất mang thông qua hấp phụ hoặc gắn
kết ằng liên kết cộng hóa trị. Tuy nhiên việc gắn kết ngẫu nhiên làm giảm đáng kể hiệu quả ứng dụng của enzyme cố định. Cố định enzyme ở vị trí xác định trên ề mặt chất mang dựa trên các phản ứng sinh học là một cách thức mới để giải quyết các vấn đề liên quan đến cố định có chọn lọc. Việc cố định này có thể đạt đƣợc ằng cách tạo liên kết giữa các nhóm hoạt động trên chất mang và các phần xác định trên phân tử protein. Bằng cách thiết kế lại các phân tử protein và iến tính ề mặt chất mang phù hợp sự gắn kết enzyme theo phƣơng pháp này có thể thực hiện ở điều kiện êm dịu tránh đƣợc hiện tƣợng mất hoạt tính của enzyme hoặc iến tính enzyme sau khi cố định. Hình 1.11 trình ày kỹ thuật gắn kết enzyme lên chất mang thông qua cầu nối (strept)avidin– iotin. Đây là phƣơng pháp đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu phổ iến. Biotin và (strept)avidin không chỉ có ái lực gắn kết cao (Kd ≈ 10−15 M) mà còn thể hiện tính đặc hiệu cao nên phƣơng pháp này đƣợc sử dụng phổ iến để cố định enzyme. Bốn vị trí gắn kết iotin xếp theo từng cặp trên các vị trí đối diện stretavidin đóng vai trò nhƣ cầu nối. Các protein đƣợc chức năng hóa với (strept)avidin thƣờng không ền với nhiệt chất gây iến tính pH chất phân giải protein chứng tỏ sự gắn kết trên là ất thuận nghịch. Ví dụ nhóm nghiên cứu của Nidumolu đã công ố tổng hợp các hạt nano từ đƣợc chức năng hóa với streptavidin và khảo sát sự gắn kết với lớp phủ ị iotin hóa trên vàng và thủy tinh ứng dụng để nhận dạng các phân tử sinh học [22]. Quá trình trải qua 3 ƣớc: Bƣớc 1: tổng hợp các hạt MNP sử dụng phƣơng pháp đồng kết tủa sau đó iến tính ề mặt của nó với streptavidin với chất hoạt hóa car odiimide; Bƣớc 2: ề mặt vàng và thủy tinh đƣợc chức năng hóa với lớp iotin ằng cách đƣa iotin-HPDP lên trên ề mặt thủy tính có phủ vàng; Bƣớc 3: các hạt nano đã đƣợc chức năng hóa gắn đặc hiệu với ề mặt vàng đã đƣợc iotin hóa.
Hình 1.11. Mô hình minh họa việc cố định enzyme lên hạt MNP oxit sắt sử dụng kĩ thuật (strept)avid.