6. Bố cục luận văn
1.9. PHẢN ỨNG THỦY PHÂN CỦA LIPIT
1.9.1. Lipit
a. Khái niệm
Lipit là chất béo, là nhóm hợp chất hữu cơ tự nhiên rất phổ biến trong tế ào động vật, thực vật, có thành phần hóa học và cấu tạo khác nhau nhƣng có tính chất chung là không hòa tan trong nƣớc mà hòa tan trong các dung môi hữu cơ (este chloroform enzene …). Lipit là hợp phần cấu tạo quan trọng của màng sinh học, là nguồn cung cấp năng lƣợng (37,6.106 J/kg), nguồn cung cấp các vitamin A D E K và F cho cơ thể.
Căn cứ vào thành phần nguyên tố có mặt ngƣời ta chia lipit làm 2 loại - Lipit đơn giản: là este của rƣợu và axit béo
- Lipit phức tạp: ngoài C, H, O còn có một số nguyên tố khác nhƣ N P S. Trong phân tử của chùng ngoài axit éo và rƣợu còn có các thành phần khác nhƣ azơ nitơ đƣờng, axit phosphoric.
b. Lipit đơn giản
những axit béo. Glycride không tan trong nƣớc, tan trong dung môi hữu cơ. Glycride có tỉ trọng nhỏ hơn nƣớc.
Điểm nóng chảy của Glycride phụ thuộc vào thành phần axit béo của Glycride điểm nóng chảy hạ khi lƣợng axit éo không ão hòa tăng.
Hình 1.12. Cấu tạo tổng quát của lipit đơn giản
(R1, R2, R3 là các gốc hiđrocac on no hoặc không no không phân nhánh có thể giống nhau hoặc khác nhau)
- Ceride (Sáp): là những ester của monoalcol cao và axit éo cao với số nguyên tử cac on chẵn. Công thức tổng quát của sáp là CH3(CH2)nCOO(CH2)mCH3 (với n= 22-34, m=15-35).
Sáp là những chất rắn ở điều kiện thƣờng có trong dịch tiết của động vật (sáp ong sáp cá voi sáp cá nhà táng…) hoặc ở dạng dự trữ của một số thực vật (sáp tạo thành lớp mỏng ao phủ trên ề mặt lá thân quả của nhiều cây).
- Steride: là những chất rắn không màu không tan trong nƣớc tan trong eter chloroform…Steride có thể ị thủy phân ởi azơ hoặc enzym thích hợp. Steride là ester của axit éo cao (thƣờng là các axit palmitic stearic và oleic) và monoalcol cao đa vòng giáp có phân tử khối lớn (đƣợc gọi chung là các sterol). Sterol là những dẫn xuất của ciclopentanopehidrophenantrene, mà 2 đại diện quan trọng của chúng là cholesterol và egosterol
.
c. Lipit phức tạp
Khác với lipit tự do có nhiệm vụ cung cấp năng lƣợng hàm lƣợng luôn thay đổi. Lipit phức tạp có nhiệm vụ tham gia xây dựng các cấu tử của tế ào hàm lƣợng không thay đổi hoặc thay đổi rất ít.
- Photpholipit: là este của rƣợu đa chức với axit éo ậc cao ngoài ra còn có thêm thành phần phụ khác nhƣ gốc axit phosphoric hoặc nitơ.
Hình 1.13.Cấu tạo tổng quát của photpholipit
- Glycolipit: là lipit phức tạp không chứa phospho, trong thành phần của chúng có chứa hexose thƣờng là galactose hay các dẫn xuất của galactose. Thuộc nhóm này có MGDG, DGDG và sulfolipit khá phổ biến trong lục lạp và các thành phần khác của tế bào ở lá. O C O R acid beo cholesterol - egosterol O C O R CH 3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 acid beo-
1.9.2. Xúc tác enzyme cho phản ứng thủy phân
a. Bản chất của quá trình thủy phân
Quá trình thủy phân là quá trình phân cắt một số liên kết nhị dƣơng (dispositive bonds) trong hợp chất hữu cơ thành các thành phần đơn phân dƣới tác dụng của các chất xúc tác và có sự tham gia của nƣớc trong phản ứng.
b. Xúc tác sinh học trong phản ứng thủy phân lipit
- Cơ sở lý thuyết về tác dụng của enzyme thủy phân vào liên kết nhị dƣơng (liên kết thủy phân)
Đa số enzyme thủy phân (hydolase) không có nhóm ngoại. Trong trung tâm hoạt động của chúng chứa các gốc axit amin đặc hiệu. Đối với hydrolase thƣờng chứa hai nhóm chức.
Theo Bernard Pullman và All erte Pullman đặc điểm chung của các chất bị thủy phân là có chứa ―liên kết bị thủy phân‖ do nguyên tử tích điện dƣơng tạo nên ngƣời ta gọi đó là ―liên kết nhị dƣơng‖.
Ví dụ: Liên kết trong phân tử lipit là một liên kết nhị dƣơng
- Cơ chế tác dụng của enzyme hydrolase theo cơ chế chung sau: E- + S+ ES PE
trong đó:
E: Enzyme S: Cơ chất
ES: Phức hợp của enzyme-cơ chất P: Sản phẩm
Giai đoạn đầu có sự hình thành phức hợp trung gian ES, sự tạo thành phức hợp có thể theo hai kiểu sau:
Kiểu cơ chế thứ nhất: là kiểu hình thành đơn giản, tâm ái nhân (-) của enzyme tƣơng tác nhanh với một trong hai nguyên tử tích điện dƣơng của liên kết nhị dƣơng. Sau khi tƣơng tác sẽ làm thay đổi mật độ electron (e) và làm suy yếu liên kết nhị dƣơng tạo điều kiện cắt đứt liên kết. Các nhà nghiên cứu cho rằng kiểu cơ chế này xảy ra khi tâm ái nhân của enzyme mạnh và sự khuyết điện tử của liên kết nhị dƣơng lớn.
Kiểu cơ chế thứ hai: lúc đầu các nguyên tử khuyết điện tử trong liên kết nhị dƣơng chƣa thể đính trực tiếp vào tâm ái nhân của trung tâm hoạt động của enzyme mà cơ chất gắn vào tâm ái nhân bằng một phản ứng hóa học nào đó giữa tâm ái nhân ở trung tâm hoạt động enzyme với một nhóm hóa học ở vị trí gần kề với liên kết nhị dƣơng trong cơ chất. Dƣới ảnh hƣởng của trung tâm hoạt động của enzyme sẽ dần dần làm tăng mức độ khuyết điện tử vốn đã tồn tại trƣớc đó ằng cách tạo liên kết tƣơng ứng với cơ chất ở những vị trí gần với liên kết nhị dƣơng. Nhờ vậy, làm cho sự phân bố điện tử trong phân tử cơ chất bị thay đổi theo chiều hƣớng cần thiết, khiến cho liên kết nhị dƣơng đƣợc tăng cƣờng và có thể tƣơng tác với các tác nhân ái nhân của trung tâm hoạt động của enzyme và tiến hành làm yếu liên kết và tiến đên liên kết bị thủy phân khi có yếu tố nƣớc tham gia.
c. Một số đặc điểm của phản ứng thủy phân bởi enzyme
Các yếu tố điều chỉnh phản ứng thủy phân: nƣớc; nhiệt độ; pH của môi trƣờng.
Ƣu điểm:
- Không tạo ra sản phẩm phụ do enzyme có tính đặc hiệu cao.
- Điều kiện thủy phân nhẹ nhàng (nhiệt độ thấp) do đóít ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phẩm.
- Điều chỉnh sản phẩm theo ý muốn, tiêu tốn ít năng lƣợng. Nhƣợc điểm:
- Thời gian thủy phân dài dẫn đến chu kỳ sản xuất kéo dài. - Muốn có hiệu quả cao phải có chế phẩm enzyme tinh khiết.
- Khó lọc hơn thủy phân bằng axit do đó cần phải nâng cao nhiệt đó để lọc, có thể khắc phục nhƣợc điểm này bằng enzyme axit.
1.10. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC CỦA ĐỀ TÀI1.10.1. Ngoài nƣớc 1.10.1. Ngoài nƣớc
Hiện nay, nghiên cứu về vật liệu hạt nano từ là một hƣớng nghiên cứu đƣợc các nhà khoa học trên thế giới đang tập trung khai thác ứng dụng đặc biệt trong lĩnh vực y sinh, cảm biến, xúc tác sinh học do những ƣu điểm nổi bậc của loại vật liệu này nhƣ: [21] kích thƣớc hạt nano có thể hiệu chỉnh phù hợp cho việc gắn kết các phân tử sinh học (tế bào, protein, gen) hoặc virut nhờ sử dụng các phƣơng pháp tổng hợp khác nhau; (2) tính đồng nhất của các hạt cao, diện tích bề mặt lớn, từ độ bão hòa lớn ngay ở nhiệt độ phòng; (3) tính tƣơng thích sinh học cao, dễ dàng biến tính bề mặt bằng các phƣơng pháp lý hóa để gắn kết các phân tử sinh học, phù hợp cho các ứng dụng có liên quan đến y sinh.
Cho đến nay, việc ứng dụng vật liệu nano từ tính để phân tách các phân tử sinh học; xúc tác và cảm biến sinh học; vận chuyển thuốc đến tế bào mục tiêu trong điều trị bệnh đặc biệt là tiêu diệt tế ào ung thƣ đã đƣợc các nhà khoa học tập trung nghiên cứu và ƣớc đầu mang lại nhiều kết quả khả quan, tạo động lực thúc đẩy nghiên cứu sâu để khai thác ƣu điểm nổi bậc của vật liệu này trong các ứng dụng liên quan đến thực tế, cụ thể nhƣ sau:
a. Phân tách và chọn lọc tế bào
Hƣớng nghiên cứu về phân tách tế ào đƣợc các nhà khoa học đang tập trung khai thác dựa vào tính chất từ của vật liệu nano oxit sắt. Các phân tử
nhận dạng đƣợc gắn trên bề mặt của MNPs đã đƣợc biến tính bởi các phân tử polyme có tính tƣơng thích sinh học cao nhƣ: dextrin polivinyl ancohol phospholipits. Các phân tử mục tiêu sẽ gắn kết đặc hiệu với các phân tử nhận dạng.Dƣới tác dụng của từ trƣờng ngoài, MNPs có gắn các phân tử mục tiêu đƣợc giữ lại, các phân tử không gắn kết sẽ đi ra ngoài. Bằng cách này, các nhà khoa học đã thành công trong việc tách tế bào hồng cầu, tế ào ung thƣ phổi, vi khuẩn, tế ào ung thƣ urological.
b. Cảm biến sinh học
Sử dụng tính chất từ tính của MNP kết hợp với phƣơng pháp phân tích quang để phát triển các hệ cảm biến sinh học đã đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu thực hiện. Các hệ cảm biến này sử dụng các phân tử nhận dạng có tính chất phát huỳnh quang gắn trên bề mặt của MNPs để xác định các phân tử mục tiêu. Dƣới tác động của từ trƣờng ngoài, MNPs sẽ chuyển động, làm tăng hiệu quả tƣơng tác giữa các phân tử nhận dạng với tế bào mục tiêu. Kĩ thuật làm giàu mẫu mới này cho phép nâng cao giới hạn phát hiện, rút ngắn thời gian phân tích và có thể dùng một lƣợng lớn mẫu so với kĩ thuật phân tích miễn dịch truyền thống.
c. Dẫn truyền thuốc
Việc dùng MNPs nhƣ là chất mang thuốc đến vị trí mục tiêu trên cơ thể (thông thƣờng dùng để điều trị các khối u ung thƣ) đã đƣợc triển khai và đang tiếp tục nghiên cứu sâu rộng trong thời gian gần đây. Phƣơng pháp này có 2 lợi ích cơ ản: (i) thu hẹp phạm vi phân bố thuốc trong cơ thể nên làm giảm tác dụng phụ của thuốc; (ii) giảm lƣợng thuốc và tăng cƣờng hiệu quả điều trị. Công nghệ này lần đầu tiên đƣợc sử dụng để định hƣớng thuốc cytotoxic đến tế ào u ƣớu đƣợc cấy ở đuôi chuột. Nghiên cứu an đầu này cho kết quả khá khả quan trong việc giúp thuyên giảm khối u ở nhóm chuột có sử dụng thuốc gắn trên MNPs, trong khi nhóm chuột có sử dụng liều thuốc cao gấp 10
lần nhƣng không gắn trên MNPs không thể hiện rõ rệt hiệu quả điều trị. Các kết quả tƣơng tự cũng đƣợc công bố trong điều trị tiêu diệt khối u trên lợn và thỏ. Nghiên cứu dẫn truyền thuốc đã đƣợc thử nghiệm rất thành công trên động vật đặc biệt trong ứng dụng để điều trị u não. Việc dẫn truyền thuốc đến các u não rất khó khăn vì thuốc cần phải vƣợt qua hàng rào ngăn cách giữa não và máu, nhờ có trợ giúp của MNPs từ có kích thƣớc 10-20 nm, việc dẫn truyền thuốc có hiệu quả hơn rất nhiều. Việc áp dụng phƣơng pháp này đối với ngƣời tuy đã có một số thành công, nhƣng còn khá khiêm tốn.
d. Xúc tác enzyme từ tính
Một trong những ứng dụng quan trọng của vật liệu MNP là dùng làm chất mang để cố định enzyme – chất xúc tác trong các phản ứng sinh hóa do những ƣu điểm của vật liệu này mang lại. Cho đến nay đã có nhiều chất mang khác nhau đƣợc lựa chọn, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nhƣ xúc tác sinh học, các thiết bị y tế, phân tán thuốc và cảm biến sinh học nhƣ polyme tổng hợp, polyme sinh học, hydrogels, chất mang vô cơ… Mỗi loại chất mang có ƣu và nhƣợc điểm riêng. Vì vậy, việc lựa chọn chất mang phù hợp là tùy thuộc vào công nghệ hiện có, yêu cầu về độ bền cơ học, sự tƣơng tác giữa chất mang với dung môi, mức độ yêu cầu về độ tinh khiết của sản phẩm, khả năng thu hồi tái sử dụng lại xúc tác …
So với các chất mang hiện đang đƣợc sử dụng rộng rãi, MNP thể hiện những ƣu điểm nổi bậc hơn cả đáp ứng các yêu cầu khắt khe của xúc tác sinh học nhƣ: (1) độ tƣơng thích sinh học cao nên hạn chế tối đa việc giảm hoặc mất hoạt tính của enzyme sau khi cố định; (2) diện tích bề mặt riêng lớn nên tăng cƣờng khả năng chất chứa enzyme và cải thiện khả năng tƣơng tác giữa enzyme và cơ chất; (3)
độ bền cao của MNPs đƣợc duy trì khi có phƣơng pháp biến tính phù hợp; (4) tính chất siêu từ của MNPs cho phép tách loại hoàn toàn enzyme ra khỏi sản phẩm phản ứng và tái sử dụng chúng. Chính vì những ƣu
điểm nổi bậc này mà trong thời gian gần đây hƣớng nghiên cứu sử dụng MNPs làm chất mang enzyme thu hút đƣợc nhiều nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu, giải quyết các vấn đề có liên quan với mục tiêu là duy trì tối đa hoạt tính enzyme sau cố định trên MNPs để có thể tái sử dụng nhiều lần. Các nhà khoa học đã nghiên cứu giải quyết các yêu cầu này ở nhiều phƣơng diện khác nhau, cụ thể nhƣ sau:
-Liên quan về tính ổn định và độ hoạt động của enzyme cố định
Để ứng dụng enzyme cố định trong sản xuất công nghiệp, độ ổn định và hoạt độ của xúc tác là hai yếu tố then chốt cần quan tâm. Để đảm bảo đƣợc yêu cầu này, Yang và các cộng sự đã đóng gói enzyme (nghiên cứu trên enzyme glucose oxidase) trong nền polyme poly (acid pyrrole-N- propylsulfonic) đƣợc bao bọc bên ngoài MNPs. Kết quả nghiên cứu cho thấy về cơ ản enzyme cố định bằng phƣơng pháp gói này hoạt động tốt với sự thay đổi pH, dung môi hữu cơ và nhiệt độ cao so với enzyme dạng tự do.
Sự ổn định về phân tán của hệ xúc tác cũng là một yếu tố khá quan trọng quyết định độ hoạt động của enzyme. Enzyme cố định trực tiếp trên MNPs trần dễ dàng ngƣng kết trong quá trình tách thu hồi tái sử dụng bằng từ trƣờng do đó hoạt tính của enzyme MNPs sẽ bị giảm một phần do sự hạn chế tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất phản ứng. Vì vậy, việc duy trì độ bền phân tán của enzyme nano từ tính là điều cần thiết. Rossi và các cộng sự đã iến tính bề mặt MNP bằng ammonium persulfate để cố định enzyme glucose oxidase [27]. Tuy nhiên, hoạt tính của enzyme chỉ còn 50% so với an đầu sau 5 lần sử dụng. Ngoài ra, nhiều nhóm nghiên cứu cũng đã cố định enzyme lên bề mặt MNPs đƣợc bọc bằng silica sau đó chức năng hóa ằng nhóm amino. Việc bọc MNP bằng silica giúp tránh đƣợc phần nào hiện tƣợng ngƣng kết nhƣng vẫn chƣa đủ lớn để đảm bảo độ bền của xúc tác enzyme MNP cho việc tái sử dụng trở lại. Lee và các cộng sự đã nghiên cứu enzyme
cố định trên MNPs có bọc silica, kết quả cho thấy hoạt tính của enzyme liên tục giảm trong suốt quá trình tái sử dụng. Sau 10 chu kì xúc tác, hoạt tính của enzyme chỉ còn lại 60% so với an đầu.
Ngoài ra phƣơng pháp cố định enzyme cũng ảnh hƣởng đến độ ổn định của hệ xúc tác. Ba phƣơng pháp cơ ản thƣờng đƣợc sử dụng để cố định enzyme trên nền chất mang, bao gồm: liên kết cộng hóa trị, hấp phụ vật lý, gói trong cấu trúc polyme. Cố định bằng liên kết cộng hóa trị có thể giúp enzyme gắn chặt lên bề mặt chất mang MNP nhƣng hoạt độ của enzyme có thể bị giảm một phần sau cố định.Trong kĩ thuật cố định enzyme bằng phƣơng pháp vật lý, enzyme gắn lên chất mang MNP bằng tƣơng tác Van der Waals hoặc tƣơng tác kỵ nƣớc. Tuy nhiên do tƣơng tác vật lý là tƣơng tác yếu nên enzyme dễ dàng tách khỏi chất mang MNPs trong điều kiện khắc nghiệt của quá trình hồi sinh tái sử dụng xúc tác. Lee và các cộng sự đã cố định enzyme lipase trên bề mặt nano từ kỵ nƣớc ngƣời ta nhận thấy hoạt tính của enzyme mất khoảng 50% sau lần sử dụng đầu tiên. Nguyên nhân đƣợc giải thích là do hiện tƣợng giải hấp phụ enzyme ra khỏi chất mang MNP ngay trong quá trình xúc tác cho phản ứng. Cũng có một vài nghiên cứu về đóng gói enzyme trong nền silica. Tuy nhiên, giống nhƣ phƣơng pháp gói enzyme