6. Bố cục luận văn
1.6. GIỚI THIỆU VỀ ENZYME
1.6.1. Khái quát về enzyme
Enzyme là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học với mức độ đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tƣơng đối thấp. Enzyme có trong tất cả các tế bào sống, là các chất xúc tác sinh học. Nó có đầy đủ tính chất của chất xúc tác nhƣng enzyme có hiệu suất xúc tác lớn hơn tất cả các chất xúc tác hữu cơ và vô cơ khác.
Dựa vào kiểu phản ứng mà enzyme xúc tác ngƣời ta phân ra thành 6 lớp chính:
- Oxydoreductase: nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa - khử. - Transferase: nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị.
- Hydrolase: nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân.
- Lyase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần nƣớc, hoặc loại nƣớc tạo thành nối đôi hoặc kết hợp phân tử nƣớc vào nối đôi.
- Isomerase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa.
- Ligase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu năng lƣợng ATP …
1.6.2. Cơ chế xúc tác của enzyme
Quá trình xúc tác của enzyme xảy ra qua 3 giai đoạn:
E + S → ES→ E + P
E – Enzyme (enzyme) S – Cơ chất (substrate) P – Sản phẩm (products) - Giai đoạn thứ nhất: Enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu, nhờ đó sẽ tạo ra phức hệ enzyme – cơ chất.
- Giai đoạn thứ hai: Khi cơ chất tạo phức với enzyme, chúng sẽ bị thay đổi cả cấu hình không gian, lẫn mức độ bền vững của các liên kết. Kết quả là các liên kết bị cũ phá vỡ và tạo ra sản phẩm.
- Giai đoạn thứ a: Đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm quá trình phản ứng đƣợc tạo thành và tách ra khỏi enzyme.
1.7. ENZYME LIPASE
1.7.1. Giới thiệu về enzyme lipase
Lipase (E.C. 3.1.1.3) là một họ các enzyme mà trong môi trƣờng tự nhiên chúng xúc tác cho các phản ứng thủy phân chất éo đƣợc ứng dụng chủ yếu để xúc tác thủy phân acylglyceride hoặc một số este khác nhƣ thiol polyol hay polyaxit este [6]. Ngoài ra, lipase còn có thể đƣợc sử dụng làm chất xúc tác trong các phản ứng tổng hợp các acylglyceride hay este có giá trị ứng dụng cao trong đời sống. Lipase có bản chất là một globulin và có thể đƣợc sản xuất từ tuyến tụy và màng dạ dày của động vật. Tuy nhiên, sinh tổng hợp lipase từ vi sinh vật mang lại độ thuần khiết và hiệu suất cao hơn. Hiện tại ngƣời ta ứng dụng rộng rãi lipase trong công nghiệp dƣợc phẩm, hóa mỹ phẩm, dệt da, chất tẩy rửa, thực phẩm hoặc tổng hợp các chất hữu cơ khác nhiên liệu sinh học (bio-fuel).
1.7.2. Nguồn thu nhận enzyme lipase
a. Từ động vật
Lipase thu nhận từ những cơ quan mô của một số loài động vật hữu nhũ đã đƣợc nghiên cứu rất nhiều, nhƣng toàn diện hơn cả là lipase có nguồn gốc từ con ngƣời và một số lipase từ tuyến tụy.
b. Từ thực vật
Lipase từ thực vật không đƣợc chú ý nhiều so với những nguồn thu nhận khác. Tuy nhiên, gần đây loại enzyme này đã ắt đẩu đƣợc quan tâm và nghiên cứu khá phổ biến. Trong đó lipase từ những hạt có dầu là đƣợc quan
tâm nhất. Những enzyme này nếu thu nhận từ nguồn nguyên liệu khác nhau thì tính đặc hiệu về cơ chất, pH tối ƣu tính kỵ nƣớc cũng khác nhau. Những enzyme này có quan hệ mật thiết với triaxylglycerol có trong bản thân hạt dầu đó và chỉ đƣợc tổng hợp trong quá trình nảy mầm của hạt [24].
c. Từ vi sinh vật
Vi sinh vật có khả năng tổng hợp một lƣợng enzyme rất lớn trong một khoảng thời gian ngắn; hoạt tính của enzyme cao hơn hoạt tính của enzyme đƣợc tổng hợp từ động vật và thực vật. Lipase đƣợc thu nhận từ vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm men và nấm mốc.
1.7.3. Đặc điểm của lipase
a. Cấu trúc
Lipase có cấu trúc α - β với vị trí trung tâm là lƣới hỗn hợp β chứa bộ ba xúc tác và có cấu trúc xoắn ngăn cản cơ chất tiếp xúc trung tâm hoạt động(hình 1.9).
Cấu trúc của lipase Rhizomucor miehei là cấu trúc dạng α - β gồm vùng lƣới β trung tâm có tám dải β liên kết song song cuộn lên trên vùng xoắn lƣỡng cực (N-terminal). Ba liên kết disunfit trong phân tử lipase, Cys29-Cys268;
Cys40-Cys43 và Cys235-Cys244 có tác dụng làm cho toàn bộ cấu trúc của enzyme đƣợc ổn định. Vùng trung tâm hoạt động của enzyme có chứa bộ ba xúc tác Scrl44 His257 và Asp203 nhƣng lại bị che phủ bởi phần không phân cực của cấu trúc xoắn lƣỡng cực ―Lid‖. ―Lid‖ là một đoạn oligopeptit kỵ nƣớc mà enzyme esterase không có [29]. Chính vì điều này đã giúp lipase hấp phụ đƣợc trên bề mặt phân chia pha dầu-nƣớc và sau đó diễn ra sự tái sắp xếp cấu trúc enzyme .
Hình 1.9. Cấu trúc của enzyme lipase Candium
Lipase từ Geotrichum candidum cũng tồn tại dƣới hai dạng đồng phân: dạng I(pI=4,56) và dạng II (pII= 4,46) có từ hai đến ba vị trí N-glycosylalion tƣơng ứng với từng dạng dồng phân. Cấu trúc của enzyme cũng có dạng α/β với lƣới hỗn hợp β hình thành ởi 11 dải trong đó có 7 dải song song với nhau. Những cấu trúc cuộn xoắn liên kết với các dải đều nằm ở hai bên vùng lƣới β. Hai liên kết disulfide đƣợc tìm thấy là Cys61-Cysl05 và Cys276- Cys288.Bộ ba xúc tác là Ser217, His463 và Glu354 nằm trong vùng trung tâm hoạt động bị che khuất bởi hai cấu trúc xoắn α gần nhƣ song song với nhau.
b. Hoạt tính bề mặt
Nhờ vào kỹ thuật X quang mà cấu trúc tinh thể của một số lipase đã đƣợc xác định. Chúng ta biết rằng trong cấu trúc đó có một phân đoạn xoắn α đƣợc gọi là ―lid‖ đã che lấp trung tâm hoạt động làm cho enzyme không thể có hoạt tính xúc tác trong dung dịch nƣớc hoặc trong dung môi hữu cơ. Nhƣng nếu trong dung dịch xuất hiện bề mặt phân chia pha giữa dầu và nƣớc thì sự hấp phụ enzyme này lên bề mặt đó sẽ làm thay đổi hình dạng enzyme dẫn đến việc mở rộng cửa rào ―lid‖ tạo điều kiện cho sự tiếp xúc cơ chất với trung tâm hoạt động.
1.7.4. Tính đặc hiệu
Dựa vào tính đặc hiệu, lipase vi sinh vật có thể đƣợc phân thành ba nhóm:
- Nhóm đầu tiên bao gồm những enzyme không đặc hiệu với vị trí hoặc cấu trúc gốc axyl trên mạch triglyxerit.
- Nhóm thứ hai đƣợc xem là quan trọng nhất bao gồm những enzyme xúc tác đặc hiệu vị trí 1, 3 trên phân tử triacylglycerol trong đó thông dụng là lipase từ Aspergillus niger, Rhitopus delemar, Mucor miehei và Pseudomonas fragi.
- Nhóm thứ ba gồm những enzyme chỉ xúc tác đặc hiệu một số axit béo nhất định.
1.7.5. Khả năng chịu nhiệt
Khả năng chịu nhiệt của lipase có liên quan đến cấu trúc phân tử enzyme. Những yếu tố của môi trƣờng nhƣ pH và ion kim loại sẽ ảnh hƣởng và làm thay đổi cấu trúc của phân tử. Ngoài ra, sự đột biến gen trong quá trình hình thành đoạn ―lid‖ cũng ảnh hƣởng đáng kể đến khả năng chịu nhiệt của lipase.
1.7.6. Khả năng chịu lực cắt
Phản ứng xúc tác bởi lipase đƣợc thực hiện trên bề mặt phân chia pha, do đó diện tích và ―chất lƣợng‖ của vùng phản ứng có ảnh hƣởng quan trọng đến tốc độ phản ứng. Kết hợp điều kiện khuấy trộn và sử dụng chất nhũ hóa sẽ làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất. Tuy nhiên, enzyme sẽ bị mất hoạt tính do cấu trúc không thể gấp khúc trên bề mặt phân chia pha khí-lỏng và lỏng- lỏng nêu sự chênh lệch lực liên kết giữa hai pha là rất lớn. Sự biến tính này tăng dần theo nhiệt độ và sự chuyển động hỗn loạn của dòng lƣu chất. Nếu tốc độ khuấy trộn tăng thì sẽ tạo ra nhiều bọt khí trong hỗn hợp phản ứng, dẫn đến tốc độ biến tính của enzyme tăng lên. Việc bổ sung phụ gia polypropylene glycol vào trong hỗn hợp phản ứng sẽ làm giảm đáng kể sự biến tính enzyme.
1.7.7. Trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác
Trung tâm hoạt động của lipase là những phân tử axit amin có vị trí xác định trên toàn bộ cấu trúc phân tử enzyme, bao gồm bộ ba xúc tác Asp (có thể thay thế bằng Glu) His và Ser đƣợc trình bày ở hình 1.10.
Hình 1.10. Trung tâm hoạt động của enzyme lipase
Phản ứng thủy phân đƣợc thực hiện nhờ bộ ba xúc tác Ser, His, Asp trải qua năm giai đoạn sau:
1. Enzyme kết hợp với cơ chất hình thành phức chất hoạt động.
2. Nhóm chức hoạt động OH của Serine tấn công vào gốc axyl của cơ chất tạo liên kết đồng hóa trị hình thành hợp chất trung gian. Giai đoạn này đƣợc hỗ trợ bởi hoạt tính xúc tác của His trong bộ ba xúc tác.
3. Tạo thành axyl enzyme và tách khỏi phản ứng oxy của liên kết este. 4. Tách gốc axyl còn lại ra khỏi trung tâm hoạt động bởi nhóm chức hoạt động của His, có sự tham gia của phân tử nƣớc và hình thành hợp chất trung gian có cấu trúc tứ diện.
5. Giải phóng axit carboxylic.
1.7.8. Ứng dụng của lipase
Lipase đƣợc sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp chế biến chất béo, thực phẩm, chất tẩy rửa, tổng hợp hóa chất và dƣợc phẩm, sản xuất giấy và các loại mỹ phẩm. Ngoài ra lipase còn đƣợc sử dụng để thúc đẩy phản ứng phân hủy chất thải dạng béo và polyurethane. Phần lớn chế phẩm lipase đƣợc thu nhận từ vi khuẩn, nấm men và nấm mốc.
a. Ứng dụng trong công nghiệp
- Công nghiệp chất tẩy rửa: Nhờ vào khả năng thủy phân chất béo, lipase đƣợc sử dụng nhƣ một loại phụ gia trong công nghiệp chất tẩy rửa.
- Công nghiệp thực phẩm: Lipase có khả năng thay đổi tính chất của chất béo bằng cách thay đổi vị trí axit béo và có thể thay thế một hoặc nhiều hơn các axit béo trên mạch glyxerol.
Sử dụng lipase cố định Rhizomucor miehei thực hiện phản ứng trao đổi este để thay thế axit palmitic của dầu cọ bằng axit stearic hoặc làm giảm hàm lƣợng axit béo mạch dài.
Lipase vi sinh vật đƣợc ứng dụng để tách và thu nhận các axít éo chƣa bão hòa từ mỡ động vật và dầu thực vật; đƣợc sử dụng trong điều chế dƣợc phẩm và thực phẩm chức năng để hạn chế hàm lƣợng cholesterol trong máu, kháng viêm và chống tắc nghẽn mạch máu.
Lipase đƣợc ứng dụng trong quá trình làm chín để tăng thêm hƣơng vị cho phô mai hay giúp loại bỏ những chất béo không mong muốn ảnh hƣởng đến mùi vị sản phẩm từ thịt, cá trong quá trình bảo quản.
- Công nghiệp sản xuất giấy: Lipase đƣợc sử dụng để loại bỏ những thành phần không ƣa nƣớc trong gỗ, chủ yếu là triglyxerit và sáp ra khỏi bột giấy trong quá trình làm giấy.
b. Ứng dụng trong tổng hợp hữu cơ
Sử dụng lipase trong tổng hợp hóa học hữu cơ ngày càng trở nên đa dạng do tính chất đặc hiệu về cơ chất, vị trí và cấu hình không gian của enzyme. Những enzyme này hoạt động trên bề mặt phân chia hai pha kỵ và ƣa nƣớc có khả năng hoạt động tốt trong dung môi hữu cơ. Ứng dụng quan trọng của lipase là tổng hợp liên kết este, tạo thành các hợp chất tạo hƣơng và nguồn nhiên liệu điesel quan trọng.
c. Ứng dụng trong chuyển hoá sinh học
Sự chuyển hóa sinh học đƣợc thực hiện dựa trên chế phẩm enzyme và vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp lipase đặc hiệu. Đối với chế phẩm enzyme, phản ứng thủy phân liên kết este đƣợc tiến hành trên bề mặt phân
chia pha và enzyme đƣợc gói trong khuôn gel thực hiện nhiều sự chuyển hóa khác nhau.
1.8. ENZYME CỐ ĐỊNH
1.8.1. Sơ lƣợc về enzyme cố định
Enzyme cố định hay enzyme không hòa tan là những enzyme hòa tan đƣợc gắn vào một chất mang bằng các kỹ thuật khác nhau. Nhờ quá trình gắn này mà enzyme từ trạng thái hòa tan chuyển sang không hòa tan.
a. Đặc điểm của enzyme cố định
Enzyme cố định có đặc điểm nhƣ sau:
- Hoạt tính của enzyme cố định thƣờng nhỏ hơn của enzyme tự do cùng loại.
- Enzyme cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaclis — Menstein - Tính bền nhiệt trội hơn enzyme tự do nhờ có tác dụng che chở của chất mang.
- pH tối ƣu không trùng với enzyme tự do cùng loại.
- Enzyme cố định đƣợc bảo vệ tốt hơn do có chất mang che chắn.
- Enzyme cố định có thể tái sử dụng nhiều lần và dễ dàng tách ra khỏi cơ chất sau phản ứng và độ bền của enzyme cố định cao hơn enzyme tự do.
b. Ưu, nhược điểm của enzyme cố định
Ƣu điểm:
- Enzyme cố định có thể tái sử dụng nhiều lần trong thời gian dài.
- Enzyme cố định không lẫn vào trong sản phẩm cuối của phản ứng enzyme do đó nó không gây ảnh hƣởng xấu đến chất lƣợng sản phẩm.
- Có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách hệ chất mang – enzyme ra khỏi dung dịch cơ chất.
- Enzyme cố định tƣơng đối bền với các tác nhân vật lý và hóa học hơn enzyme tự do.
- Dễ dàng tiến hành quá trình sản xuất theo phƣơng pháp liên tục.
Nhƣợc điểm:
- Sự có mặt của chất mang có thể làm giảm hoạt tính của enzyme.
- Trong đa số trƣờng hợp, enzyme có thể bị giảm hay mất hoạt tính sau quá trình cố định.
c. Phương pháp cố định enzyme
Phƣơng pháp cố định enzyme đƣợc chia ra thành hai loại: vật lý và hoá học
Phƣơng pháp hoá học:
- Gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị.
- Gắn các phân tử enzym lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trị.
Phƣơng pháp vật lý:
- Hấp phụ enzyme lên chất mang bằng liên kết vật lý nhƣ sau: lực maoquản, liên kết ion...
- Phƣơng pháp nhốt enzyme trong khuôn gel hoặc màng bao vi thể.
1.8.2. Kĩ thuật cố định enzyme trên chất mang nano
a. Cố định enzyme bằng phương pháp vật lý
Cố định enzyme ằng phƣơng pháp vật lý có thể đƣợc xem là phƣơng pháp đơn giản nhất. Phƣơng pháp này có thể thực hiện dễ dàng ằng cách nhúng chất mang vào trong dung dịch có chứa enzyme mà không cần đƣa thêm tác nhân gắn kết nào vào dung dịch chứa enzyme hoặc phải xử lý ề mặt chất mang hay iến tính protein [25]. Nhiều nghiên cứu cố định enzyme lên ề mặt MNP oxit sắt đã đƣợc thực hiện ằng phƣơng pháp vật lý nhƣ enzyme glucose oxidase đƣợc cố định lên các hạt nano từ tính Fe3O4 ằng phƣơng pháp vật lý để khử oxy trong nƣớc; và hiệu suất cố định đạt đƣợc là 78% với hoạt độ riêng của enzyme cố định là 640 UI/g [17] . Ở một trƣờng hợp khác enzyme pectinase đã đƣợc cố định trên ề mặt hạt nano tích điện
âm AOT-Fe3O4và hoạt độ riêng cực đại của enzyme sau cố định đạt đƣợc là (1,98 UI/mgenzyme) với hiệu suất cố định đạt đƣợc là 610,5 mg enzyme/g chất mang; hoạt tính của enzyme cố định chỉ mất đi 10 -20% sau 6 chu kỳ xúc tác. Mặc dù phƣơng pháp cố định vật lý là đơn giản và có thể thực hiện ở điều kiện êm dịu ằng các liên kết yếu nhƣ liên kết hydro lực Van der Waals. Phƣơng pháp này thƣờng liên quan đến sự tƣơng tác tƣơng đối yếu nhƣ tƣơng tác kỵ nƣớc; độ ổn định của enzyme cố định chịu ảnh hƣởng mạnh ởi các điều kiện môi trƣờng ên ngoài nhƣ pH nhiệt độ lực ion, nồng độ phân tử sinh học... Vì vậy enzyme đƣợc cố định ằng phƣơng pháp vật lý có khuynh hƣớng dễ dàng ị tách khỏi chất mang dẫn đến việc mất hoạt tính và gây tạp nhiễm hỗn hợp sản phẩm phản ứng; điều này đã ảnh hƣởng đến khả năng tái sử dụng cũng nhƣ độ hoạt động cho enzyme cố định đặc iệt đối với các enzyme cố định của hệ cảm iến. Hơn nữa enzyme cố định ằng phƣơng pháp vật lý thƣờng ị iến tính hoặc giảm hoạt tính do sự thay đổi về cấu