6. Bố cục luận văn
2.1. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ, THIẾT BỊ
2.1.1. Hóa chất
Các hóa chất đƣợc sử dụng trong đề tài nghiên cứu này là hóa chất tinh khiết phân tích gồm: Sắt(II) clorua tetrahiđrat Sắt(III) clorua hexahiđrat dung dịch amoniac Chitosan, Glutaraldehyde 25%, axit axetic, Natri hidrophophat Natri đihiđrophophat enzyme lipase khí Argon nƣớc cất 2 lần. Các hóa chất trên đều đƣợc sử dụng trực tiếp mà không cần tinh chế lại.
- Dung dịch các muối sắt đƣợc chuẩn bị bằng cách hòa tan muối rắn trong nƣớc cất 2 lần.
- Dung dịch chitosan 1% đƣợc chuẩn bị bằng cách hoà tan 1g chitosan rắn trong dung dịch axit axetic 1%, khuấy qua đêm trên máy khuấy từ ở nhiệt độ phòng cho đến tan hoàn toàn sau đó lọc loại bỏ cặn.
- Dung dịch glutaraldehyde đƣợc chuẩn bị bằng cách hòa tan trong nƣớc cất đến nồng độ cần dùng trƣớc ngay khi sử dụng đậy kín và bảo quản ở 40C để tránh hiện tƣợng ay hơi làm giảm nồng độ dung dịch.
- Dung dịch đệm phosphate pH = 7,4
Dung dịch A (NaH2PO4 0.1 M): chuẩn bị bằng cách hòa tan 1,56 g NaH2PO4.2H2O trong 100 ml nƣớc cất.
Dung dịch B (Na2HPO4 0.1M): chuẩn bị bằng cách hòa tan 3,59 g Na2HPO4.12H2O trong 100 ml nƣớc cất.
Lấy 20 ml dung dịch A trộn lẫn với 80 ml dung dịch B, hiệu chỉnh pH đến giá trị bằng 7,4 .
-Dung dịch enzyme lipase: enzyme lipase an đầu có hoạt độ 1011 UI/g đƣợc hòa tan trong dung dịch đệm phosphate pH = 7 4 ngay trƣớc khi thí
nghiệm. Mẫu đƣợc bảo quản ở 4 0C để tránh hiện tƣợng giảm hoạt tính của enzyme.
2.1.2. ụng cụ thiết ị
- Dụng cụ thủy tinh: ình cầu a cổ sinh hàn ống đong cốc thủy tinh pipet phễu ình tam giác đũa thuỷ tinh nhiệt kế.
- Các thiết ị: máy khuấy từ và gia nhiệt ếp điện cân phân tích tủ sấy tủ lạnh…
- Thiết ị phân tích: đo phổ IR chụp TEM chụp SEM chụp XRD đo từ tính đo sắc ký GC-MS.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Tổng hợp hạt nano sắt từ (Fe3O4NPs) bằng phƣơng pháp đồng kết tủa
Hòa tan hỗn hợp hai muối FeCl3.6H2O và FeCl2.4H2O (tỉ lệ mol 2:1) vào nƣớc cất trong bình cầu 3 cổ, khuấy ở nhiệt độ thƣờng trên máy khuấy từ gia nhiệt. Thêm từ từ vào dung dịch amoniac đến khi dung dịch chuyển sang màu đen. Sau đó tiến hành gia nhiệt dung dịch phản ứng ở nhiệt độ 800
C trong 30 phút sau đó nâng lên 1200
C trong 2h thu đƣợc hệ huyền phù Fe3O4NPs. Phản ứng tổng hợp Fe3O4 NPs đƣợc tiến hành trong môi trƣờng trơ ằng cách liên tục sục khí Ar để loại bỏ oxy.
Dung dịch keo Fe3O4NPs đƣợc để nguội đến nhiệt độ phòng. Thu hồi bằng từ trƣờng ngoài, rửa bằng nƣớc cất đến pH trung tính. Lƣu giữ ở nhiệt độ phòng đến khi sử dụng.
Sơ đồ quy trình tổng hợp hạt nano sắt từ (Fe3O4 NPs) đƣợc trình bày ở hình 2.1.
Hình 2.1. Quy trình tổng hợp hạt nano sắt từ (Fe3O4 NPs) FeCl2.4H2O FeCl3.6H2O Dung dịch màu đỏ nâu Nƣớc cất Khuấy Dung dịch amoniac NH4OH Dung dịch màu đen Khuấy
1. Khuấy và gia nhiệt ở 800
C, sau nâng lên 1200C. 2. Thu hồi sản phẩm 3. Rửa bằng nƣớc cất đến pH trung tính Nano oxit sắt từ (Fe3O4NPs)
2.2.2. Biến tính bề mặt Fe3O4NPs bằng cách phủ chitosan
Việc phủ chitosan lên trên bề mặt Fe3O4 NPs đƣợc thực hiện theo sơ đồ trình bày ở hình 2.2. Hình 2.2. Quy trình tổng hợp hạt Fe3O4 NPs phủ chitosan Nano oxit sắt từ (Fe3O4NPs) Dung dịch Chitosan 1% Hỗn hợp dung dịch Khuấy Hỗn hợp dung dịch Khuấy Dung dịch Glutaradehyde 0,1% 1. Thu hồi sản phẩm 2. Rửa bằng nƣớc cất loại bỏ chitosan không gắn kết
Nano oxit sắt từ phủ chitosan (Fe3O4NPs - Chitosan)
Cho một lƣợng chính xác Fe3O4NPs đã đƣợc điều chế ở trên vào dung dịch chitosan 1%, khuấy đều trên máy khuấy từ để đảm bảo sự phân tán đồng đều của Fe3O4NPs trong nền chitosan. Tiếp theo đó dung dịch glutaradehyde 0 1% đƣợc thêm vào hỗn hợp trên, khuấy đều trong 2 giờ. Dùng từ trƣờng ngoài thu hồi Fe3O4NPs đã đƣợc phủ chitosan sau đó rửa lại nhiều lần bằng nƣớc cất để loại bỏ những chitosan hòa tan không gắn kết thu đƣợc Fe3O4
NPs phủ chitosan, kí hiệu (Fe3O4NPs)– CS.
2.2.3. Cố định enzyme lipase lên hạt nano sắt từ (Fe3O4NPs)–CS
Quy trình cố định enzyme lipase lên trên bề mặt (Fe3O4NPs)– CS đƣợc thực hiện theo sơ đồ trình bày ở hình 2.3.
Cho Fe3O4 NPs – CS vào hỗn hợp dung dịch glutaraldehyde 5%. Hỗn hợp đƣợc khuấy ở nhiệt độ phòng trong 5 giờ. Sản phẩm đã đƣợc hoạt hóa glutaraldehyde đƣợc thu hồi bằng từ trƣờng ngoài và rửa bằng nƣớc cất. Sau đó cho chất mang vào dung dịch lipase (d = 2g/l) , khuấy trong 2 giờ. Thu hồi sản phẩm bằng phân tách từ tính và rửa giải bằng dung dịch đệm photphat để loại bỏ enzyme tự do, kí hiệu (Fe3O4NPs)– CS - lipase.
Hình 2.3 .Quy trình tổng hợp lipase cố định
2.2.4. Phản ứng thủy phân lipit với xúc tác enzyme cố định
Mẫu nghiên cứu phản ứng thủy phân dầu thực vật dƣới tác dụng xúc tác của enzyme nano từ tính Fe3O4NPs–CS – lipase đƣợc thực hiện ở nhiệt độ trong khoảng từ 35 - 40oC. Đây chính là khoảng nhiệt độ thuận lợi để enzyme có khả năng thể hiện hoạt tính xúc tác tốt nhất.
Fe3O4NPs - Chitosan Dung dịch đệm phosphate pH ≈ 7 4 Khuấy Dung dịch Glutaradehyde 5% Hỗn hợp dung dịch Thu hồi sản phẩm bằng từ trƣờng và rửa bằng nƣớc cất loại bỏ Glutaraldehyde dƣ Chất mang đƣợc hoạt hóa bề mặt Dung dịch Lipase (1011UI/g) 1. Khuấy 2. Thu hồi sản phẩm 3. Rửa bằng đệm phosphate để loại bỏ enzyme lipase tự do không gắn kết
Lipase cố định
Chuẩn bị các mẫu thực hiện phản ứng thủy phân theo tỉ lệ về thể tích 1 : 5 giữa dầu và nƣớc, lần lƣợt nhƣ sau:
- Mẫu 1 (mẫu đối chứng): hỗn hợp phản ứng chỉ có chứa 5 ml dầu và 25 ml nƣớc, không thêm enzyme.
- Mẫu 2 (mẫu đối chứng, thực hiện với enzyme lipase tự do): hỗn hợp phản ứng gồm 5 ml dầu và 25 ml nƣớc, thêm 5 ml enzyme lipase tự do pha trong đệm phosphate vào hỗn hợp.
- Mẫu 3 (mẫu kiểm chứng, thực hiện với xúc tác của enzyme nano từ tính Fe3O4NPs – CS – lipase): hỗn hợp phản ứng gồm 5 ml dầu và 25 ml nƣớc thêm 5 ml enzyme lipase trong đệm phosphate (0,002 gam Fe3O4NPs – CS – lipase/ml đệm phosphate pH 7,4).
Khuấy và gia nhiệt ở nhiệt độ 30 ÷ 400C. Quan sát sự thay đổi ở các mẫu theo thời gian.
2.2.5. Phân tích đặc trƣng vật liệu
a. Phân tích xác định kích thước và hình thái bề mặt bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Hình dạng và kích thƣớc của các hạt Fe3O4NPs trƣớc và sau khi phủ chitosan đƣợc xác định thông qua chụp ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM) có độ phân giải cao trên máy JEOL JEM 1100 tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng.
Mẫu Fe3O4NPs, Fe3O4NPs - CS đƣợc phân tán trong dung môi ethanol trƣớc khi đo. Mẫu đƣợc nhỏ trên tấm lƣới đồng đƣợc làm khô qua đêm trƣớc khi tiến hành đo xác định hình dạng và kích thƣớc.
b. Phân tích xác định hình thái bề mặt của sản phẩm bằng phương pháp đo SEM
Hình thái bề mặt của sản phẩm Fe3O4NPs– CS và Fe3O4NPs– CS–lipase đƣợc xác định thông qua chụp ảnh SEM trên máy JEOL 5410-LVC tại Viện
Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng. Mẫu chụp đƣợc chuẩn bị bằng cách nhỏ dung dịch lỏng có chứa mẫu phân tích xuống ăng C đƣợc cố định trên giá chụp. Mẫu đƣợc làm khô qua đêm. Để cải thiện độ dẫn của mẫu ngƣời ta phủ một lớp mỏng Pt lên trên bề mặt trƣớc khi tiến hành đo.
c. Phân tích cấu trúc tinh thể của sản phẩm bằng phương pháp đo nhiễu xạ tia X
Cấu trúc tinh thể của các hạt Fe3O4NPs đã tổng hợp và và kiểm tra sự thay đổi cấu trúc F3O4NPs sau khi phủ chitosan cũng nhƣ cố định enzyme lipase đƣợc xác định ằng nhiễu xạ tia X (XRD). Các mẫu sản phẩm đƣợc thu hồi ằng từ trƣờng ngoài sấy khô sau đó để tiến hành đo nhiễu xạ tia X (XRD) để xác định cấu trúc tinh thể.
d. Phân tích từ tính của sản phẩm bằng phương pháp đo đường cong từ trễ
Từ tính của hạt Fe3O4NPs trƣớc và sau khi phủ chitosan; cố định enzyme trên ề mặt vật liệu composit Fe3O4NPs – chitosan đƣợc xác định ằng phƣơng pháp đo đƣờng cong từ trễ trên máy PPMS 6000 ( Mỹ) sản xuất tại Viện Khoa học Vật liệu dựa trên nguyên lý của hệ từ kế mẫu rung (VSM). Dựa vào đƣờng cong từ trễ ta có thể biết đƣợc độ từ bão hòa của vật liệu đã tổng hợp và sự thay đổi của nó sau khi bị biến tính bởi các phân tử polyme hoặc các phân tử sinh học.
Từ trễ là hiện tƣợng bất thuận nghịch giữa quá trình từ hóa và đảo từ ở các vật liệu sắt từ do khả năng giữ lại từ tính của các vật liệu sắt từ. Đây là một đặc trƣng quan trọng và dễ thấy nhất ở các chất sắt từ. Nguyên tắc chung của phép đo từ trễ là đo sự biến đổi của mômen từ hoặc cảm ứng từ theo sự thay đổi của từ trƣờng. Từ trƣờng đặt vào đƣợc biến đổi theo một chu trình (từ giá trị 0 đến giá trị cực đại, sau đó giảm dần và đổi chiều đến từ trƣờng ngƣợc hƣớng, và lại đảo trở lại giá trị cực đại an đầu).
e. Đánh giá hiệu quả biến tính bề mặt của Fe3O4NPs bằng các tác nhân hữu cơ
Hiệu quả phủ chitosan và khả năng gắn kết enzyme lipase lên ề mặt Fe3O4NPs đƣợc đánh giá thông qua đo phổ hồng IR trong vùng từ 400 4.000 cm-1 tại Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lƣờng chất lƣợng 2. Phép đo đƣợc thực hiện trên mẫu rắn nhƣ sau:
Trộn 2mg mẫu với 98 mg KBr khan, nghiền trên cối thạch anh sau đó nén thành viên trên máy ép ở áp suất cao. Mẫu nền đƣợc thực hiện với KBr khan.
Dựa vào các dao động hóa trị (ký hiệu: ν) và dao động động biến dạng (kí hiệu: δ) đặc trƣng của các nhóm liên kết thu nhận đƣợc từ phổ đồ, ta có thể khẳng định hiệu quả của quá trình biến tính bề mặt của Fe3O4NPs bằng chitosan và kết quả cố định enzyme lipase trên chất mang Fe3O4NPs – CS.
2.2.6. Phân tích sản phẩm phản ứng thủy phân bằng phƣơng pháp sắc kí GC-MS sắc kí GC-MS
Sản phẩm của phản ứng thủy phân lipit dầu thực vật bằng hệ xúc tác nano enzyme từ tính Fe3O4NPs – CS– lipase đƣợc xác định bằng phƣơng pháp phân tích GC-MS tại Công ty cổ phần dịch vụ khoa học công nghệ sắc ký Hải Đăng Tp. Hồ Chí Minh.
Sản phẩm của phản ứng thủy phân đƣợc chiết 3 lần với dung môi n- hexan sau đó mẫu đƣợc phân tích xác định hàm lƣợng axit béo bằng phƣơng pháp phân tích sắc kí GC-MS.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TỔNG HỢP Fe3O4NPS BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỒNG KẾT TỦA VÀ PHÂN TÍCH CÁC ĐẶC TRƢNG CỦA NÓ VÀ PHÂN TÍCH CÁC ĐẶC TRƢNG CỦA NÓ
3.1.1. Tổng hợp Fe3O4NPs
Chúng tôi tiến hành điều chế nano oxit sắt từ Fe3O4NPs bằng phƣơng pháp đồng kết tủa từ hỗn hợp dung dịch Fe2+
và Fe3+ với chất tạo kết tủa keo là dung dịch amoniac (NH4OH). Đây là phƣơng pháp tổng hợp Fe3O4NPs từ môi trƣờng đồng thể theo quy trình đƣợc trình bày ở tiểu mục 2.3.1.
Cân chính xác 5,41g FeCl3.6H2O và 1,99g FeCl2.4H2O (tỉ lệ mol Fe 3+ :Fe2+ = 2 : 1) cho vào bình cầu 3 cổ, thêm tiếp 50ml nƣớc cất, khuấy liên tục trên máy khuấy từ đồng thời sục khí Ar trong 30 phút để loại bỏ toàn bộ oxy có trên bề mặt dung dịch chất phản ứng cũng nhƣ oxy hòa tan.
Thêm từ từ từng giọt 30ml dung dịch amoniac vào hỗn hợp trên trên từ phiễu chiết, lúc này hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy kĩ liên tục và vẫn sục Ar để đảm bảo môi trƣờng trơ. Lắp sinh hàn, tiến hành gia nhiệt hỗn hợp phản ứng ở 800
C trong 30 phút sau đó nâng nhiệt độ lên 1200C trong 2h. Sản phẩm thu đƣợc là dung dịch màu đen đậm đó chính là các hạt Fe3O4NPs phân tán trong nƣớc. Sản phẩm phản ứng Fe3O4NPs đƣợc để nguội đến nhiệt độ phòng, thu hồi bằng cách áp từ trƣờng ngoài vào bình phản ứng, loại bỏ phần dung dịch. Rửa sản phẩm bằng nƣớc cất từ 3 – 4 lần để loại bỏ hoàn toàn các tạp chất ám vào đến khi pH dung dịch rửa đạt trung tính.
Phản ứng để hình thành các hạt nano Fe3O4NPs nhƣ sau: Fe2+ + 2Fe3+ + 8OH-→ Fe3O4 + 4H2O
Màu sắc của sản phẩm và sự tách loại dƣới tác dụng của từ trƣờng ngoài đƣợc trình bày ở hình 3.1.
Các hạt Fe3O4NPs trần điều chế đƣợc kém bền trong môi trƣờng phân tán là nƣớc, theo thời gian chúng dễ dàng kết tụ và lắng xuống đáy ình. Để các Fe3O4NPs có khả năng phân tán tốt trong môi trƣờng nƣớc, thì cần thiết phải biến tính bề mặt của nó bằng cách sử dụng các chất hoạt động bề mặt hoặc phủ một lớp mỏng polyme ƣa nƣớc trên bề mặt.
Hình 3.1. Màu sắc của sản phẩm Fe3O4NPs được điều chế bằng phương pháp đồng kết tủa từ hỗn hợp dung dịch Fe2+
và Fe3+ với chất tạo kết tủa keo là dung dịch amoniac theo tỉ lệ mol Fe3+ : Fe2+ = 2 : 1. (a). Trước khi áp từ
trường ngoài; (b). Sau khi áp từ trường ngoài
3.1.2. Phân tích các đặt trƣng của Fe3O4NPs
Mẫu sau khi tổng hợp đƣợc tiến hành phân tích các đặc trƣng của huyền phù Fe3O4NPs thu đƣợc theo quy trình đã trình ày ở chƣơng 2 tiểu mục 2.2.5.
Để khẳng định huyền phù điều chế đƣợc là các hạt Fe3O4NPs, chúng tôi tiến hành phân tích sản phẩm bằng phƣơng pháp phân tích nhiễu xạ tia X, chụp ảnh hiển vi truyền qua TEM, chụp ảnh hiển vi quét SEM và đo độ từ bão hòa bằng phƣơng pháp đo đƣờng cong từ trễ.
1. Kết quả hành chụp ảnh hiển vị điện tử quét qua SEM của mẫu Fe3O4NPs ở hình 3.2 cho thấy các hạt nano oxit sắt tạo thành ở dạng hình cầu và có kích thƣớc tƣơng đối đồng nhất.
2.
3. Hình 3.2.Ảnh chụp SEM của Fe3O4NPs được điều chế bằng phương pháp đồng kết tủa từ hỗn hợp dung dịch Fe2+
và Fe3+ theo tỉ lệ mol Fe3+ : Fe2+ = 2 : 1.
4. Đồng thời, chúng tôi tiến hành chụp ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của mẫu lỏng thu đƣợc đối với hệ huyền phù Fe3O4NPs đã điều chế. Kết quả thể thể hiện ở hình 3.3 cho thấy các hạt Fe3O4NPs tạo thành có kích thƣớc nằm trong khoảng 12 – 18 nm, ngoài ra còn có một số hạt có kích thƣớc lớn hơn.
5. Để khẳng định cấu trúc tinh thể sản phẩm nano Fe3O4NPs, chúng tôi tiến hành thực hiện phép phân tích nhiễu xạ tia X để đƣợc xác định cấu trúc tinh
thể. Kết quả phân tích đƣợc trình bày ở hình 3.4. Trên phổ nhiễu xạ tia X có xuất hiện 6 đỉnh nhiễu xạ có cƣờng độ cao, ứng với các góc 2θ lần lƣợt là 30,13o; 35,65o; 43,12o; 53,65o; 57,16o và 62,86o. Đây chính là các đỉnh nhiễu xạ đặc trƣng cho các mặt (200), (311), (400), (422), (511) và (440) của mạng cấu trúc tinh thể spinel Fe3O4. Kết quả thu đƣợc từ phổ đồ phù hợp với các đỉnh nhiễu xạ của Fe3O4 chuẩn, vì vậy ta có thể khẳng định đƣợc mẫu sản phẩm là Fe3O4NPs.
6.
7.
8.
Hình 3.3. Ảnh chụp TEM của Fe3O4NPs được điều chế bằng phương pháp đồng kết tủa từ hỗn hợp dung dịch Fe2+
và Fe3+ theo tỉ lệ mol Fe3+:Fe2+=2 :1.
Độ từ bão hòa của mẫu Fe3O4NPs đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo đƣờng cong từ trễ đƣợc. Kết quả thể hiện ở hình 3.5 cho thấy đƣợc sản phẩm điều chế đƣợc có độ từ bão hòa là khá cao 47,92 emu/g so với các công bố
trƣớc đây [10]; đồng thời lực kháng từ của mẫu gần nhƣ ằng 0 nên hạt vẫn mang tính siêu thuận từ.
9.
Hình 3.4. Giản đồ nhiễu xạ tia X của hạt Fe3O4NPs được điều chế bằng phương pháp đồng kết tủa từ hỗn hợp dung dịch Fe2+
và Fe3+ theo tỉ lệ mol Fe3+:Fe2+= 2:1
Hình 3.5. Đường cong từ trễ của Fe3O4NPs được điều chế bằng phương pháp đồng kết tủa từ hỗn hợp dung dịch Fe2+
3.2. TỔNG HỢP VÀ PHÂN TÍCH CÁC ĐẶC TRƢNG CỦA VẬT LIỆU Fe3O4NPs – CHITOSAN (Fe3O4NPs – CS) Fe3O4NPs – CHITOSAN (Fe3O4NPs – CS)