6. Bố cục luận văn
3.2.2. Phân tích các đặc trƣng của Fe3O4NPs-CS
Để kiểm chứng hiệu quả bao phủ chitosan lên hạt Fe3O4NPs, chúng tôi tiến hành phân tích mẫu sản phẩm Fe3O4NPs-CS bằng phƣơng pháp đo phổ hồng ngoại (IR), nhiễu xạ tia X, chụp ảnh hiển vi điện tử truyền qua TEM, chụp ảnh hiển vi quét qua SEM và đo độ từ bão hòa.
Ảnh chụp TEM của mẫu huyền phù Fe3O4NPs-CS đã tổng hợp thể hiện trong hình 3.6b cho thấy kích thƣớc của hạt của Fe3O4NPs - CS có sự thay đổi so với Fe3O4NPs trần an đầu (hình 3.6a) với giới hạn kích thƣớc mới nằm trong khoảng 13 – 22 nm. Nhƣ vậy, việc phủ chitosan đã làm thay đổi kích thƣớc hạt Fe3O4NPs.
Hình 3.6. Ảnh chụp TEM của (a) Fe3O4NPs và (b) Fe3O4NPs - CS
Mẫu Fe3O4NPs-CS cũng đƣợc chụp ảnh hiển vi điện tử quét qua SEM, kết quả thu đƣợc thể hiện trong hình 3.7b. Qua hình ảnh có thể thấy đƣợc có lớp chitosan đã đƣợc phủ lên trên bề mặt của các hạt nano oxit sắt từ (Fe3O4NPs) vì thế đã làm thay đổi một phần nào bề mặt của chất mang và cũng góp phần Fe3O4NPs có khả năng phân tán tốt trong môi trƣờng nƣớc phân cực.
Kết quả đo phổ hồng ngoại (IR) đƣợc thể hiện trong hình 3.8. Trên phổ của Fe3O4NPs – CS, có sự xuất hiện tần số dao động tại 589 cm-1 đặc trƣng cho liên kết Fe–O của Fe3O4. Ngoài ra, trên phổ đồ còn xuất hiện dao động 1636 cm-1, 1419 cm-1 và 1049 cm-1 tƣơng ứng với tần số dao động 1653 cm-1, 1379 cm-1, 1081 cm-1 đặc trƣng cho liên kết N-H, C-OH và C-O-C của phân tử chitosan. Điều này, ta có thể khẳng định chitosan đã đƣợc phủ lên trên bề mặt của hạt Fe3O4NPs.
Kết quả phân tích nhiễu xạ tia X của Fe3O4NPs – CS đƣợc trình bày ở hình 3.9. Trên phổ đồ cũng xuất hiện 6 đỉnh đặc trƣng của cấu trúc tinh thể Fe3O4 nhƣng cƣờng độ bị giảm đáng kể. Điều này có thể đƣợc giải thích là do việc phủ chitosan lên bề mặt hạt Fe3O4 đã làm thay đổi một phần nào bề mặt nhiễu xạ vì thế làm thay đổi cƣờng độ phản xạ bề mặt nhƣng vẫn không làm thay đổi cấu trúc mạng tinh thể của hạt Fe3O4 sau khi phủ chitosan. Chứng tỏ đƣợc rằng chitosan đã có mặt trên bề mặt của hạt Fe3O4
Hình 3.8. Phổ hồng ngoại (IR) của Fe3O4NPs; Chitosan; Fe3O4NPs- CS
Kết quả đo độ từ bão hòa thể hiện trong hình 3.10 cho thấy giá trị độ từ bão hòa của Fe3O4NPs – CS là 41,77 emu/g, thấp hơn so với độ từ bão hòa an đầu của Fe3O4NPs là 47,92 emu/g. Nguyên nhân là do chitosan đã phủ lên bề mặt Fe3O4NPs, làm giảm độ từ bão hòa của vật liệu nhƣng giảm không đáng kể. Lực kháng từ của mẫu Fe3O4NPs – CS xác định đƣợc gần nhƣ ằng 0 nên hạt sau khi phủ chitosan, Fe3O4NPs vẫn mang tính siêu thuận từ. Nhƣ vậy độ từ bão hòa của Fe3O4NPs– CS vẫn đảm bảo cho ứng dụng cố định enzyme lipase để có thể tách khỏi hỗn hợp phản ứng sau xúc tác.
Hình 3.9. Phổ nhiễu xạ tia X của hạt Fe3O4NPs (a); Fe3O4NPs-CS (b)
Hình 3.10. Đường cong từ trễ của Fe3O4NPs; Fe3O4NPs-CS
-60,00 -40,00 -20,00 0,00 20,00 40,00 60,00 -15000 -10000 -5000 0 5000 10000 15000 Fe3O4NPs Fe3O4NPs-CS
3.3. CỐ ĐỊNH ENZYME LIPASE LÊN BỀ MẶT VẬT LIỆU Fe3O4NPs- CS VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TRƢNG SẢN PHẨM
3.3.1. Cố định enzyme lipase lên bề mặt vật liệu Fe3O4NPs- CS
Quá trình cố định enzyme lipase lên bề mặt Fe3O4NPs – chitosan đƣợc thực hiện thông qua cầu nối glutaraldehyde. Lợi dụng đặc điểm chung giữa phân tử chitosan trên bề mặt Fe3O4NPs và enzyme lipase là đều có mặt nhóm amin (-NH2), vì vậy glutaraldehyde là cầu nối của enzyme lipase và Fe3O4NPs thông qua việc hình thành liên kết C=N do tƣơng tác giữa nhóm amin (-NH2) và nhóm cacbonyl (-CHO) đƣợc trình ày nhƣ sau:
Fe3O4NPs –Chitosan – N=CH – (CH2)3 – CH=N – Lipase
Việc cố định enzyme lipase lên chất mang đƣợc thực hiện theo quy trình 2.3.3:
- Cho 2g Fe3O4NPs-CS sau khi đƣợc tổng hợp vào dung dịch đệm photphat (pH ≈ 7 4) đựng trong bình tam giác, thêm vào 20ml dung dịch glutaraldehyde 5% và khuấy trong 5 giờ ở nhiệt độ phòng. Sản phẩm đã đƣợc hoạt hóa glutaraldehyde đƣợc thu hồi và rửa bằng nƣớc cất.
- Chất mang sau khi đã hoạt hóa bằng glutaraldehyde đƣợc trộn vào 20ml dung dịch enzyme lipase trong đệm photphat. Hỗn hợp đƣợc khuấy nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ để enzyme tƣơng tác với các phân tử glutaraldehyde và gắn kết bền vững trên nền chất mang để yên trong 30 phút. Sản phẩm Fe3O4NPs-CS - enzyme đƣợc thu hồi bằng từ trƣờng bên ngoài, rửa bằng nƣớc cất để loại bỏ enzyme tự do không gắn kết. Mẫu đƣợc bảo quản ở nhiệt độ thấp để tránh hiện tƣợng biến tính tính làm giảm hoạt tính của enzyme đã cố định.
3.3.2. Phân tích các đặc trƣng Fe3O4NPs- CS - lipase
Chúng tôi thu hồi sản phẩm, sấy khô ở nhiệt độ 400C và tiến hành xác định đặc trƣng ằng các phƣơng pháp nhƣ đo phổ hồng ngoại (IR), nhiễu xạ tia X và độ từ bão hòa của sản phẩm để kiểm chứng sự cố định của enzyme lipase lên bề mặt chất mang (Fe3O4NPs/CS). Ngoài ra, chụp ảnh hiển vi quét qua SEM kiểm tra sự hình thái bề mặt của xúc tác Fe3O4NPs- CS - lipase.
Từ phổ đồ IR thể hiện ở hình 3.11. của Fe3O4NPs- CS – lipase, có sự xuất hiện của dao động tại 1647cm-1 đặc trƣng cho khoảng dao động của liên kết C=N. Đó là kết quả phản ứng của nhóm cacbonyl (-CHO) trong phân tử glutaraldehyde và nhóm NH2 của chitosan và enzyme lipase. Ngoài ra, còn có xuất hiện các dao động tại 1458 cm-1, 1054 cm-1 tƣơng ứng với các dao động 1429 cm-1 và 1012 cm-1 trong phổ hồng ngoại của enzyme lipase tự do, chứng tỏ lipase đã đƣợc cố định thành công trên chất mang Fe3O4NPs- CS.
Hình 3.11. Phổ hồng ngoại (IR) của enzyme lipase tự do và lipase cố định
Kết quả trên cũng phù hợp với kết quả thu đƣợc rút ra từ giản đồ nhiễu xạ tia X của mẫu enzyme cố định thể hiện ở hình 3.12. Trên giản đồ vẫn xuất hiện 6 đỉnh đặc trƣng cho cấu trúc tinh thể của Fe3O4 tại có các góc 2θ nhƣ giản đồ của Fe3O4NPs-CS, nhƣng cƣờng độ nhiễu xạ thì thấp hơn so với Fe3O4NPs-CS. Tƣơng tự độ từ bão hòa của mẫu enzyme cố định có giá trị là 37,99 emu/g giảm so với Fe3O4NPs/CS điều này đƣơc thể hiện ở đƣờng cong từ trễ trên hình 3.13. Sự cố định enzyme lipase đã làm giảm độ tự bão hòa cũng nhƣ thay đổi bề mặt của chất mang. Với những kết quả thu thập ở trên, có thể kết luận rằng enzyme lipase đã đƣợc cố định thành công trên bề mặt chất mang.
Hình 3.12. Phổ nhiễu xạ XRD của Fe3O4NPs(a), Fe3O4NPs-CS(b) và Fe3O4NP-CS-lipase(c)
Hình 3.13. Đường cong từ trễ của Fe3O4NPs, Fe3O4NPs-CS và Fe3O4NPs-CS-Lipase -60,00 -40,00 -20,00 0,00 20,00 40,00 60,00 -15000 -10000 -5000 0 5000 10000 15000
Qua kết quả chụp ảnh hiểm vi quét qua SEM của chất mang sau khi cố định enzyme lipase đƣợc thể hiện trong hình 3.14. Từ hình ảnh cũng nhƣ là so sánh với hình 3.7b, ta có thể thấy đƣợc sau khi cố định enzyme lên bề mặt chất mang không làm thay đổi kích thƣớc cũng nhƣ ít ảnh hƣởng đến những đặc tính vốn có của chất mang.
Hình 3.14. Ảnh chụp SEM của Fe3O4NPs-CS-Lipase
3.4. PHẢN ỨNG THỦY PHÂN LIPIT DẦU THỰC VẬT VỚI XÚC TÁC NANO ENZYME TỪ TÍNH Fe3O4NPs-CS-LIPASE NANO ENZYME TỪ TÍNH Fe3O4NPs-CS-LIPASE
3.4.1. Phản ứng thủy phân lipit dầu thực vật dƣới tác dụng xúc tác của nano enzyme từ tính Fe3O4NPs-CS-Lipase của nano enzyme từ tính Fe3O4NPs-CS-Lipase
Chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng thủy phân dầu thực vật bằng hệ xúc tác đã tổng hợp Fe3O4NPs-CS-Lipase theo quy trình 2.2.4. Các mẫu thí nghiệm đều đƣợc ủ ở 35oC trong suốt thời gian phản ứng.
Sau 24 giờ ủ, các mẫu có sự khác nhau rõ rệt độ đục. Sản phẩm của quá trình thủy phân lipit là glixerol và các axit béo - là những hợp chất không tan
trong nƣớc. Axit éo không tan trong nƣớc, vì thế khi khuấy sẽ tạo thành hệ nhũ tƣơng làm cho hỗn hợp bị đục (hình 3.15). Lƣợng axit béo tạo thành càng nhiều thì sẽ làm cho hệ nhũ tƣơng càng ị đục hơn. Hiện tƣợng này cũng có thể thấy đƣợc ở hệ nhũ tƣơng của dung dịch chứa enzyme cố định, chứng tỏ enzyme sau khi cố định lên chất mang vẫn còn hoạt tính xúc tác.
Hình 3.15. Các mẫu phản ứng sau khi ủ trong 24 giờ.
Tiếp tục ủ hỗn hợp phản ứng ở điều kiện trên trong 5 ngày. Dùng từ trƣờng ngoài thu hồi enzyme cố định. Sau đó hỗn hợp sản phẩm phản ứng đƣợc chiết với n-hexan để thu lấy các axit éo. Phân tích hàm lƣợng axit béo sau thủy phân bằng phƣơng pháp sắc kí khí để xác định hiệu quả chuyển hóa lipit của enzyme nano từ tính đã tổng hợp.
3.4.2. Phân tích sản phẩm phản ứng thủy phân lipit dầu thực vật dƣới tác dụng xúc tác của nano enzyme từ tính Fe3O4NPs-CS-Lipase dƣới tác dụng xúc tác của nano enzyme từ tính Fe3O4NPs-CS-Lipase
Kết quả phân tích sắc kí khí sản phẩm của phản ứng thủy phân đƣợc trình bày ở hình 3.16. Thành phần axit béo trong dung dịch sau khi thủy phân đƣợc trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần của axit béo có trong sản phẩm của phản ứng thủy phân STT Thời gian lƣu % diện tích Tên sản phẩm Kí hiệu 1 8.99 0.73 Tetradecanoic acid (C14:0) C14:0 2 9.82 32.33 Hexadecanoic acid (C16:0) C16:0 3 10.71 3.89 Octadecanoic acid (C18:0) C18:0 4 10.93 41.26 Cis-9-Octadecenoic acid (C18:1) C18:1 5 11.3 19.92 Cis-9,12-Octadecadienoic acid (C18:2) C18:2 6 11.6 0.21 6,9,12-Octadecatrienoic acid (C18:3) C18:3 7 11.75 0.46 Eicosanoic acid (C20:0) C20:0 8 11.8 1.19 Cis-9,12,15-Octadecatrienoic acid (C18:3) C18:3
Từ kết quả ở bảng 3.1 cho thấy phƣơng pháp GC-MS đã xác định đƣợc 8 loại axit béo có trong hỗn hợp sau khi thủy phân dầu thực vật từ enzyme lipase cố định trên hạt nano từ tính. Hai axit béo chủ yếu đƣợc thủy phân là axitcis-9-Octadecenoic (41.26 %) và axit Hexadecanoic (32.33%).
Hình 3.16. Phổ GC-MS dịch chiết n-hexan của hỗn hợp sau khi thủy phân chất béo
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. KẾT LUẬN
Sau khi tìm hiểu tài liệu và tiến hành thực nghiệm tôi đã đạt đƣợc kết quả sau:
Thứ nhất, tổng hợp thành công Fe3O4NPs bằng phƣơng pháp đồng kết tủa từ hỗn hợp muối FeCl2 và FeCl3, với dung dịch amoniac là chất tạo kết tủa. Tiến hành phân tích các đặc trƣng của sản phẩm Fe3O4NPs đã xác định:
- Sản phẩm tạo thành có cấu trúc của mạng tinh thể Fe3O4.
- Hạt Fe3O4NPs từ có kích thƣớc tƣơng đối đồng nhất và đƣờng kính hạt trong khoảng 12 – 18 nm.
- Sản phẩm Fe3O4NPs có tính siêu thuận từ với độ từ bão hòa là 47,92 emu/g và lực kháng từ gần bằng 0.
Hạt nano oxit sắt từ đƣợc tổng hợp mang đầy đủ những tính chất đặc trƣng thuận lợi cho các ƣớc tiến hành thực nghiệm của đề tài.
Thứ hai, xây dựng đƣợc quy trình phủ chitosan lên bề mặt hạt nano Fe3O4 với mục tiêu tạo một lớp màng bao bọc để bảo vệ cấu trúc lõi Fe3O4, cũng nhƣ tạo giá thể để cố định enzyme. Sản phẩm Fe3O4NPs – CS thu đƣợc có sự thay đổi về hình thái bề mặt tăng lên về kích thƣớc nhƣng không đáng kể kích thƣớc nằm trong khoảng 13 – 22nm độ từ bão hòa giảm xuống còn 41,77 emu/g do sự bao phủ của phân tử chitosan nhƣng vẫn không phá vỡ cấu trúc mạng tinh thể của Fe3O4 cũng nhƣ là đặc trƣng tính siêu thuận từ đặc trƣng của vật liệu Fe3O4NPs.
Thứ ba, xây dựng đƣợc quy trình cố định đƣợc enzyme lipase lên bề mặt chất mang (Fe3O4-chitosan). Lợi dụng đặc điểm chung giữa phân tử chitosan trên bề mặt Fe3O4 và enzyme lipase là đều có mặt nhóm amin (- NH2), vì vậy glutaraldehyde đã đƣợc chọn để tạo cầu nối giữa enzyme lipase và chất mang thông qua việc hình thành liên kết C=N do tƣơng tác giữa nhóm
amin (-NH2) và nhóm cacbonyl (-CHO). Việc cố định enzyme lipase bằng phƣơng pháp hóa học thông qua liên kết cộng hóa trị đã giúp cho enzyme gắn bền chặt trên chất mang mà không làm thay đổi đặc tính vốn quý của Fe3O4NPs. Lipase cố định trên chất mang thể hiện độ ổn định cao, bền, khó bị biến tính.
Thứ tƣ đã thực hiện thành công phản ứng thủy phân lipit dầu thực vật xúc tác bằng hệ enzyme nano từ tính Fe3O4NPs – CS – lipase. Sản phẩm của phản ứng đƣợc thể hiện trên sắc ký đồ.
2. KIẾN NGHỊ
Dựa vào quy trình tổng hợp enzyme cố định lipase làm tiền đề tổng hợp các enzyme cố định khác có tính ứng dụng cao nhƣ: glucose oxidase protease …
Tiếp tục nghiên cứu các điều kiện tối ƣu tổng hợp Fe3O4NPs-CS-Lipase. Nghiên cứu quy trình tái thu hồi enzyme cố định hiệu suất và hoạt tính cao.
Ứng dụng sản phẩm enzyme cố định vào trong nhiều lĩnh vực nhƣ: Cảm biến sinh học dƣợc phẩm, chụp cộng hƣởng từ (MRI) …
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
[1] Lê Thị Hồng Diễm (2009), Chế tạo hạt nano Fe3O4 và khảo sát một số tính chất đặc trưng Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh.
[2] Trần Thị Dung (2007), Chế tạo nghiên cứu tính chất từ của hạt nano Fe3O4 ứng dụng trong y sinh, tạp chí khoa học ĐHQGHN Khoa học tự nhiên và công nghệ.
[3] Nguyễn Bảo Dƣ (2011) Công nghệ cố định enzyme và ứng dụng, Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh.
[4] TS. Nguyễn Hoàng Hải, Ứng dụng hạt nano từ tính oxit sắt Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội.
Tiếng Anh
[5] Batlle,X.;Labarta (2002),A.J. Phys.D:Appl. Phys.
[6] Chen YZ, Ching CB, Xu R (2009), Lipase immobilization on modified zirconia nanoparticles: Studies on the effects on modifiers, Precess Biochem
[7] Corr,S.A.; Gunko,Y.K.; Douvalis,A.P.; Venkatesan,M.; Gunning, R.D (2004),J.Mater. Chem..
[8] Couto,G.G.;Klein,J.J.;Schreiner,W.H.;Mosca,D.H.;deOliveira,A.J. A.;Zarbin,A.J.G (2007.),.J. ColloidInterface Sci.
[9] Denizot,B.; Tanguy,G.; Hindre,F.; Rump,E.; Jacques Le Jeune, Jallet (1999),J.Colloid Interface Sci, 209, 66.
[10] Duguet E et al (2006), Magnetic nanoparticles and their applications in medicine. Nanomedicine.
[11] Fang C, Zhang MQ (2009), Multifunctional magnetic nanoparticles for medical imaging applications, J Mater Chem.
[13] Kim,D.;Zhang,Y.;Voit,W.;Rao,K.;Muhammed (2005),M.J.Magn.Magn. Mater.225, 30.
[14] Kruis, F. E.; Fissan,H.; Peled (1998), A.Journal of Aerosol Science,29,511.
[15] Laurent,S.;Forge,D.;Port, M.;Roch,A.;Robic,C.;VanderElst,L.;Muller (2008),R. Chem. Rev..
[16] Lim,J.K.;Tilton,R.D.;Eggeman,A.;Majetich (2007),S.A. J.Magn.Magn. Mater.
[17] Liu, Y.; Jia, S.; Wu, Q.; Ran, J.; Zhang (2011), Studies of Fe3O4- chitosan nanoparticles prepared by co-precipitation under the magnetic field for lipase immobilization,Catal. Comm.
[18] Lu,A.; Salabas, E.;Schuth (2007),F.Angew.Chem. Int. Ed.
[19] Lu,Y.; Yin,Y.; Mayers,B. T.; Xia (2002), Y.NanoLett.
[20] Mateo, C.; Palomo, J.M.; Fernandez-Lorente, G.; Guisan, J.M.; Fernandez-Lafuente (2007) ―R.Improvement of enzyme activity, sta ility and selectivity via immo ilization techniques‖, Enzyme Microb. Technol, 40, pp.1451–1463.
[21] Molday R S and MacKenzie (2010) ― Immunospecific ferromagnetic iron–dextran reagents for the labeling and magnetic separation of cells‖ J. Immunol. Methods, 52, pp.353–67
[22] Nidumolu,B.G.; Urbina,M.C.; Hormes,J.; Kumar,C.S.;Monroe (2006), ― W.T.Functionalizationof Gold and Glass Surfaces with MagneticNanoparticlesUsingBiomolecularInteractions‖
Biotechnol.Prog, 22, pp.91–95.
[23] Neuberger,T.; Schöpf,B.; Hofmann,H.; Hofmann,M.; VonRechenberg (2005), B.J.Magn. Magn.Mater.
by the Reactions they Catalyse, International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB).
[25] Ozturk, N.; Akgol, S.; Arısoy, M.; Denizli (2007), ―A. Reversible adsorptionof lipase on novel hydropho ic nanospheres‖ Sep. Purif. Technol, 58, pp. 83–90.
[26] Petkar M Lali A Caimi P Daminati M (2006) ―Immo ilization of lipase for nonaqueous synthesis‖ J Mol Catal B Enzym, 39, pp. 83- 90.
[27] Rossi, L.; Quach, A.; Rosenzweig (2004), ―Glucose oxidase–magnetite nanoparticle bioconjugate for glucosesensing‖ Anal. Bioanal. Chem. 380, pp. 606-613
[28] Shen,L.; Laibinis, P.E.; Hatton (1999),T.A.Langmuir.
[29] Wong D.W.S (1995), Food Enzyme: Structure and Mechamism, Chapman & Hall,New York.
[30] Wu Y, Wang YJ, Lou GS, Dai YY (2009), ―In situ preparation of magnetic Fe3O4-chitosan nanoparticles for lipase immobilization by cross-linking and oxidation in aqueous solution”, Bioresource Technol, 100, pp. 3459-3464.