6. Bố cục luận văn
1.10. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC CỦA ĐỀ TÀI
1.10.1. Ngoài nƣớc
Hiện nay, nghiên cứu về vật liệu hạt nano từ là một hƣớng nghiên cứu đƣợc các nhà khoa học trên thế giới đang tập trung khai thác ứng dụng đặc biệt trong lĩnh vực y sinh, cảm biến, xúc tác sinh học do những ƣu điểm nổi bậc của loại vật liệu này nhƣ: [21] kích thƣớc hạt nano có thể hiệu chỉnh phù hợp cho việc gắn kết các phân tử sinh học (tế bào, protein, gen) hoặc virut nhờ sử dụng các phƣơng pháp tổng hợp khác nhau; (2) tính đồng nhất của các hạt cao, diện tích bề mặt lớn, từ độ bão hòa lớn ngay ở nhiệt độ phòng; (3) tính tƣơng thích sinh học cao, dễ dàng biến tính bề mặt bằng các phƣơng pháp lý hóa để gắn kết các phân tử sinh học, phù hợp cho các ứng dụng có liên quan đến y sinh.
Cho đến nay, việc ứng dụng vật liệu nano từ tính để phân tách các phân tử sinh học; xúc tác và cảm biến sinh học; vận chuyển thuốc đến tế bào mục tiêu trong điều trị bệnh đặc biệt là tiêu diệt tế ào ung thƣ đã đƣợc các nhà khoa học tập trung nghiên cứu và ƣớc đầu mang lại nhiều kết quả khả quan, tạo động lực thúc đẩy nghiên cứu sâu để khai thác ƣu điểm nổi bậc của vật liệu này trong các ứng dụng liên quan đến thực tế, cụ thể nhƣ sau:
a. Phân tách và chọn lọc tế bào
Hƣớng nghiên cứu về phân tách tế ào đƣợc các nhà khoa học đang tập trung khai thác dựa vào tính chất từ của vật liệu nano oxit sắt. Các phân tử
nhận dạng đƣợc gắn trên bề mặt của MNPs đã đƣợc biến tính bởi các phân tử polyme có tính tƣơng thích sinh học cao nhƣ: dextrin polivinyl ancohol phospholipits. Các phân tử mục tiêu sẽ gắn kết đặc hiệu với các phân tử nhận dạng.Dƣới tác dụng của từ trƣờng ngoài, MNPs có gắn các phân tử mục tiêu đƣợc giữ lại, các phân tử không gắn kết sẽ đi ra ngoài. Bằng cách này, các nhà khoa học đã thành công trong việc tách tế bào hồng cầu, tế ào ung thƣ phổi, vi khuẩn, tế ào ung thƣ urological.
b. Cảm biến sinh học
Sử dụng tính chất từ tính của MNP kết hợp với phƣơng pháp phân tích quang để phát triển các hệ cảm biến sinh học đã đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu thực hiện. Các hệ cảm biến này sử dụng các phân tử nhận dạng có tính chất phát huỳnh quang gắn trên bề mặt của MNPs để xác định các phân tử mục tiêu. Dƣới tác động của từ trƣờng ngoài, MNPs sẽ chuyển động, làm tăng hiệu quả tƣơng tác giữa các phân tử nhận dạng với tế bào mục tiêu. Kĩ thuật làm giàu mẫu mới này cho phép nâng cao giới hạn phát hiện, rút ngắn thời gian phân tích và có thể dùng một lƣợng lớn mẫu so với kĩ thuật phân tích miễn dịch truyền thống.
c. Dẫn truyền thuốc
Việc dùng MNPs nhƣ là chất mang thuốc đến vị trí mục tiêu trên cơ thể (thông thƣờng dùng để điều trị các khối u ung thƣ) đã đƣợc triển khai và đang tiếp tục nghiên cứu sâu rộng trong thời gian gần đây. Phƣơng pháp này có 2 lợi ích cơ ản: (i) thu hẹp phạm vi phân bố thuốc trong cơ thể nên làm giảm tác dụng phụ của thuốc; (ii) giảm lƣợng thuốc và tăng cƣờng hiệu quả điều trị. Công nghệ này lần đầu tiên đƣợc sử dụng để định hƣớng thuốc cytotoxic đến tế ào u ƣớu đƣợc cấy ở đuôi chuột. Nghiên cứu an đầu này cho kết quả khá khả quan trong việc giúp thuyên giảm khối u ở nhóm chuột có sử dụng thuốc gắn trên MNPs, trong khi nhóm chuột có sử dụng liều thuốc cao gấp 10
lần nhƣng không gắn trên MNPs không thể hiện rõ rệt hiệu quả điều trị. Các kết quả tƣơng tự cũng đƣợc công bố trong điều trị tiêu diệt khối u trên lợn và thỏ. Nghiên cứu dẫn truyền thuốc đã đƣợc thử nghiệm rất thành công trên động vật đặc biệt trong ứng dụng để điều trị u não. Việc dẫn truyền thuốc đến các u não rất khó khăn vì thuốc cần phải vƣợt qua hàng rào ngăn cách giữa não và máu, nhờ có trợ giúp của MNPs từ có kích thƣớc 10-20 nm, việc dẫn truyền thuốc có hiệu quả hơn rất nhiều. Việc áp dụng phƣơng pháp này đối với ngƣời tuy đã có một số thành công, nhƣng còn khá khiêm tốn.
d. Xúc tác enzyme từ tính
Một trong những ứng dụng quan trọng của vật liệu MNP là dùng làm chất mang để cố định enzyme – chất xúc tác trong các phản ứng sinh hóa do những ƣu điểm của vật liệu này mang lại. Cho đến nay đã có nhiều chất mang khác nhau đƣợc lựa chọn, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nhƣ xúc tác sinh học, các thiết bị y tế, phân tán thuốc và cảm biến sinh học nhƣ polyme tổng hợp, polyme sinh học, hydrogels, chất mang vô cơ… Mỗi loại chất mang có ƣu và nhƣợc điểm riêng. Vì vậy, việc lựa chọn chất mang phù hợp là tùy thuộc vào công nghệ hiện có, yêu cầu về độ bền cơ học, sự tƣơng tác giữa chất mang với dung môi, mức độ yêu cầu về độ tinh khiết của sản phẩm, khả năng thu hồi tái sử dụng lại xúc tác …
So với các chất mang hiện đang đƣợc sử dụng rộng rãi, MNP thể hiện những ƣu điểm nổi bậc hơn cả đáp ứng các yêu cầu khắt khe của xúc tác sinh học nhƣ: (1) độ tƣơng thích sinh học cao nên hạn chế tối đa việc giảm hoặc mất hoạt tính của enzyme sau khi cố định; (2) diện tích bề mặt riêng lớn nên tăng cƣờng khả năng chất chứa enzyme và cải thiện khả năng tƣơng tác giữa enzyme và cơ chất; (3)
độ bền cao của MNPs đƣợc duy trì khi có phƣơng pháp biến tính phù hợp; (4) tính chất siêu từ của MNPs cho phép tách loại hoàn toàn enzyme ra khỏi sản phẩm phản ứng và tái sử dụng chúng. Chính vì những ƣu
điểm nổi bậc này mà trong thời gian gần đây hƣớng nghiên cứu sử dụng MNPs làm chất mang enzyme thu hút đƣợc nhiều nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu, giải quyết các vấn đề có liên quan với mục tiêu là duy trì tối đa hoạt tính enzyme sau cố định trên MNPs để có thể tái sử dụng nhiều lần. Các nhà khoa học đã nghiên cứu giải quyết các yêu cầu này ở nhiều phƣơng diện khác nhau, cụ thể nhƣ sau:
-Liên quan về tính ổn định và độ hoạt động của enzyme cố định
Để ứng dụng enzyme cố định trong sản xuất công nghiệp, độ ổn định và hoạt độ của xúc tác là hai yếu tố then chốt cần quan tâm. Để đảm bảo đƣợc yêu cầu này, Yang và các cộng sự đã đóng gói enzyme (nghiên cứu trên enzyme glucose oxidase) trong nền polyme poly (acid pyrrole-N- propylsulfonic) đƣợc bao bọc bên ngoài MNPs. Kết quả nghiên cứu cho thấy về cơ ản enzyme cố định bằng phƣơng pháp gói này hoạt động tốt với sự thay đổi pH, dung môi hữu cơ và nhiệt độ cao so với enzyme dạng tự do.
Sự ổn định về phân tán của hệ xúc tác cũng là một yếu tố khá quan trọng quyết định độ hoạt động của enzyme. Enzyme cố định trực tiếp trên MNPs trần dễ dàng ngƣng kết trong quá trình tách thu hồi tái sử dụng bằng từ trƣờng do đó hoạt tính của enzyme MNPs sẽ bị giảm một phần do sự hạn chế tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất phản ứng. Vì vậy, việc duy trì độ bền phân tán của enzyme nano từ tính là điều cần thiết. Rossi và các cộng sự đã iến tính bề mặt MNP bằng ammonium persulfate để cố định enzyme glucose oxidase [27]. Tuy nhiên, hoạt tính của enzyme chỉ còn 50% so với an đầu sau 5 lần sử dụng. Ngoài ra, nhiều nhóm nghiên cứu cũng đã cố định enzyme lên bề mặt MNPs đƣợc bọc bằng silica sau đó chức năng hóa ằng nhóm amino. Việc bọc MNP bằng silica giúp tránh đƣợc phần nào hiện tƣợng ngƣng kết nhƣng vẫn chƣa đủ lớn để đảm bảo độ bền của xúc tác enzyme MNP cho việc tái sử dụng trở lại. Lee và các cộng sự đã nghiên cứu enzyme
cố định trên MNPs có bọc silica, kết quả cho thấy hoạt tính của enzyme liên tục giảm trong suốt quá trình tái sử dụng. Sau 10 chu kì xúc tác, hoạt tính của enzyme chỉ còn lại 60% so với an đầu.
Ngoài ra phƣơng pháp cố định enzyme cũng ảnh hƣởng đến độ ổn định của hệ xúc tác. Ba phƣơng pháp cơ ản thƣờng đƣợc sử dụng để cố định enzyme trên nền chất mang, bao gồm: liên kết cộng hóa trị, hấp phụ vật lý, gói trong cấu trúc polyme. Cố định bằng liên kết cộng hóa trị có thể giúp enzyme gắn chặt lên bề mặt chất mang MNP nhƣng hoạt độ của enzyme có thể bị giảm một phần sau cố định.Trong kĩ thuật cố định enzyme bằng phƣơng pháp vật lý, enzyme gắn lên chất mang MNP bằng tƣơng tác Van der Waals hoặc tƣơng tác kỵ nƣớc. Tuy nhiên do tƣơng tác vật lý là tƣơng tác yếu nên enzyme dễ dàng tách khỏi chất mang MNPs trong điều kiện khắc nghiệt của quá trình hồi sinh tái sử dụng xúc tác. Lee và các cộng sự đã cố định enzyme lipase trên bề mặt nano từ kỵ nƣớc ngƣời ta nhận thấy hoạt tính của enzyme mất khoảng 50% sau lần sử dụng đầu tiên. Nguyên nhân đƣợc giải thích là do hiện tƣợng giải hấp phụ enzyme ra khỏi chất mang MNP ngay trong quá trình xúc tác cho phản ứng. Cũng có một vài nghiên cứu về đóng gói enzyme trong nền silica. Tuy nhiên, giống nhƣ phƣơng pháp gói enzyme trong nền polyme không có hạt nhân từ tính phƣơng pháp này cũng ộc lộ nhiều yếu điểm do sự tƣơng tác hạn chế giữa enzyme và chất mang nên có hiện tƣợng enzyme bị tách ra khỏi chất mang trong suốt quá trình phản ứng và tái chế.
- Liên quan đến đặc tính từ của enzyme MNP để tách và tái sử dụng
Dễ dàng tách ra khỏi hỗn hợp sản phẩm phản ứng bằng cách áp dụng từ trƣờng bên ngoài là một tính năng độc đáo của các enzyme cố định trên MNPs mà các enzyme cố định khác không có đƣợc. Với mục tiêu có đƣợc hiệu quả tách tốt nhất, các nhà khoa học cũng đã tập trung nghiên cứu các
phƣơng pháp tổng hợp MNPs có độ từ bão hòa cao và từ dƣ ằng 0 bằng các phƣơng pháp khác nhau. Lee và các cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp MNP siêu từ theo phƣơng pháp tổng hợp mixen đảo. Tuy nhiên tính đồng nhất về kích thƣớc và độ bền của các hạt nano từ vẫn còn là vấn đề cần đƣợc nghiên cứu sâu rộng.
-Liên quan đến khả năng phân tán trong môi trường nước
Do các phản ứng sinh hóa xảy ra trong dung môi là nƣớc, vì vậy độ bền của MNPs trong môi trƣờng nƣớc là yếu tố cần quan tâm để đảm bảo các enzyme MNP có khả năng hoạt động tốt, tránh hiện tƣợng ngƣng kết làm giảm hoạt tính của enzyme cố định do các hạn chế liên quan đến sự tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất. Hong và các cộng sự đã tổng hợp các polyme ƣa nƣớc để bọc MNPs bằng phản ứng trùng hợp quang hóa tại chỗ [23]. Lee đã chứng minh tính ƣa nƣớc của polyme này bằng khả năng phân tán tốt trong nƣớc nhƣng không ền khi tập hợp trong dung môi hữu cơ n-hexan [24]. Ngoài ra các hƣớng nghiên cứu liên quan đến chức năng hóa ề mặt MNPs cũng đƣợc nghiên cứu rất đa dạng. Có rất nhiều công bố sử dụng amine là chất chức năng hóa trung gian cho MNPs. Việc sử dụng các nhóm chelating cũng là một kĩ thuật phổ biến đƣợc sử dụng.
1.10.2. Trong nƣớc
Hiện nay hƣớng nghiên cứu về vật liệu MNP đã và đang đƣợc các nhà khoa học trong nƣớc tiếp cận trong một vài ứng dụng, mà chủ yếu chỉ dùng làm vật liệu hấp phụ để tách kim loại nặng trong nƣớc. Tuy nhiên, việc sử dụng vật liệu này cho mục đích có giá trị cao hơn liên quan đến các ứng dụng trong y sinh vẫn chƣa đƣợc quan tâm đặc biệt là việc sử dụng MNPs làm chất mang xúc tác enzyme.
Bên cạnh đó hƣớng nghiên cứu về xúc tác enzyme đƣợc các nhà khoa học trong nƣớc tập trung khai thác cho các ứng dụng khác nhau nhƣ xử lý
nƣớc thải, chế biến thực phẩm, thuộc da, phân tích nhanh, …. Tuy nhiên, enzyme chỉ đƣợc nghiên cứu và sử dụng ở dạng hòa tan hoặc cố định trên nền thô (polyme hữu cơ hoặc vật liệu vô cơ) nên hiệu quả tƣơng tác giữa enzyme với cơ chất là không lớn và là nguyên nhân gây giảm hiệu suất chuyển hóa. Ngoài ra, việc tái sử dụng chúng vẫn là vấn đề cần đƣợc xem xét.
Hiện nay, nghiên cứu nano enzyme từ tính là hƣớng đi mới trên thế giới. Tuy nhiên, ở Việt Nam hƣớng nghiên cứu này vẫn chƣa đƣợc quan tâm đúng mức do hạn chế về thông tin khoa học cũng nhƣ đòi hỏi sự hiểu biết sâu rộng ở nhiều lĩnh vực công nghệ có liên quan. Chính những lí do trên, việc triển khai hƣớng nghiên cứu này ở Việt Nam là điều cần thiết.
CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ, THIẾT BỊ 2.1.1. Hóa chất 2.1.1. Hóa chất
Các hóa chất đƣợc sử dụng trong đề tài nghiên cứu này là hóa chất tinh khiết phân tích gồm: Sắt(II) clorua tetrahiđrat Sắt(III) clorua hexahiđrat dung dịch amoniac Chitosan, Glutaraldehyde 25%, axit axetic, Natri hidrophophat Natri đihiđrophophat enzyme lipase khí Argon nƣớc cất 2 lần. Các hóa chất trên đều đƣợc sử dụng trực tiếp mà không cần tinh chế lại.
- Dung dịch các muối sắt đƣợc chuẩn bị bằng cách hòa tan muối rắn trong nƣớc cất 2 lần.
- Dung dịch chitosan 1% đƣợc chuẩn bị bằng cách hoà tan 1g chitosan rắn trong dung dịch axit axetic 1%, khuấy qua đêm trên máy khuấy từ ở nhiệt độ phòng cho đến tan hoàn toàn sau đó lọc loại bỏ cặn.
- Dung dịch glutaraldehyde đƣợc chuẩn bị bằng cách hòa tan trong nƣớc cất đến nồng độ cần dùng trƣớc ngay khi sử dụng đậy kín và bảo quản ở 40C để tránh hiện tƣợng ay hơi làm giảm nồng độ dung dịch.
- Dung dịch đệm phosphate pH = 7,4
Dung dịch A (NaH2PO4 0.1 M): chuẩn bị bằng cách hòa tan 1,56 g NaH2PO4.2H2O trong 100 ml nƣớc cất.
Dung dịch B (Na2HPO4 0.1M): chuẩn bị bằng cách hòa tan 3,59 g Na2HPO4.12H2O trong 100 ml nƣớc cất.
Lấy 20 ml dung dịch A trộn lẫn với 80 ml dung dịch B, hiệu chỉnh pH đến giá trị bằng 7,4 .
-Dung dịch enzyme lipase: enzyme lipase an đầu có hoạt độ 1011 UI/g đƣợc hòa tan trong dung dịch đệm phosphate pH = 7 4 ngay trƣớc khi thí
nghiệm. Mẫu đƣợc bảo quản ở 4 0C để tránh hiện tƣợng giảm hoạt tính của enzyme.
2.1.2. ụng cụ thiết ị
- Dụng cụ thủy tinh: ình cầu a cổ sinh hàn ống đong cốc thủy tinh pipet phễu ình tam giác đũa thuỷ tinh nhiệt kế.
- Các thiết ị: máy khuấy từ và gia nhiệt ếp điện cân phân tích tủ sấy tủ lạnh…
- Thiết ị phân tích: đo phổ IR chụp TEM chụp SEM chụp XRD đo từ tính đo sắc ký GC-MS.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Tổng hợp hạt nano sắt từ (Fe3O4NPs) bằng phƣơng pháp đồng kết tủa
Hòa tan hỗn hợp hai muối FeCl3.6H2O và FeCl2.4H2O (tỉ lệ mol 2:1) vào nƣớc cất trong bình cầu 3 cổ, khuấy ở nhiệt độ thƣờng trên máy khuấy từ gia nhiệt. Thêm từ từ vào dung dịch amoniac đến khi dung dịch chuyển sang màu đen. Sau đó tiến hành gia nhiệt dung dịch phản ứng ở nhiệt độ 800
C trong 30 phút sau đó nâng lên 1200
C trong 2h thu đƣợc hệ huyền phù Fe3O4NPs. Phản ứng tổng hợp Fe3O4 NPs đƣợc tiến hành trong môi trƣờng trơ ằng cách liên tục sục khí Ar để loại bỏ oxy.
Dung dịch keo Fe3O4NPs đƣợc để nguội đến nhiệt độ phòng. Thu hồi bằng từ trƣờng ngoài, rửa bằng nƣớc cất đến pH trung tính. Lƣu giữ ở nhiệt độ phòng đến khi sử dụng.
Sơ đồ quy trình tổng hợp hạt nano sắt từ (Fe3O4 NPs) đƣợc trình bày ở hình 2.1.
Hình 2.1. Quy trình tổng hợp hạt nano sắt từ (Fe3O4 NPs) FeCl2.4H2O FeCl3.6H2O Dung dịch màu đỏ nâu Nƣớc cất Khuấy Dung dịch amoniac NH4OH Dung dịch màu đen Khuấy
1. Khuấy và gia nhiệt ở 800