7. Cấu trúc của luận văn
2.1. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT
2.1.1.Nguyên liệu nghiên cứu
Nguyên liệu được chọn là thân rễ cây sâm cau tại tỉnh Quảng Ngãi. Cây sâm cau ở vùng núi tỉnh Quảng Ngãi có hình dạng như ở Hình 2.1. Nguyên
liệu được chia ra làm 2 loại là rễ non và rễ già.
Hình 2.1. Cây sâm cau ở tỉnh Quảng Ngãi
2.1.2.Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ thí nghiệm
-Bộ chiết Soxhlet.
-Máy đo sắc ký ghép khối phổ GC – MS (Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng II, số 2 – Ngô Quyền – Đà Nẵng).
-Máy đo điểm chảy, máy quang phổ.
-Tủ sấy, lò nung, cân phân tích, cốc thủy tinh, bình tam giác, ống nghiệm, bếp điện, cốc sứ, các loại pipet, bình định mức…
Hóa chất
-n–hexan. -Diclometan. -Etyl axetat. -Metanol
2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.2.1.Phương pháp xử lý mẫu
Rễ cây sâm cau sau khi được đào lên, rửa sạch có hình dạng như Hình 2.2. Sau khi thu hoạch rễ cây sâm cau, thân rễ hư được loại bỏ.
Hình 2.2. Rễ cây sâm cau
Rễ sâm cau sau khi được chia ra rễ non và rễ già, tiếp tục được cắt lát. Một phần rễ tươi được lấy để nghiên cứu thông số hóa lý của mẫu tươi, phần còn lại phơi khô dưới ánh nắng mặt trời. Sau khi phơi khô, rễ sâm cau được sấy ở nhiệt độ thích hợp. Nguyên liệu được sấy từng phần trong tủ sấy ở 50oC trong ít nhất 12 giờ rồi xay nhỏ thành bột như Hình 2.3 và được bảo quản trong bình thủy tinh kín. Chất lượng thành phần các chất trong nguyên liệu phụ thuộc nhiều vào các yếu tố môi trường như đất, nước, nhiệt độ, độ ẩm,…
Hình 2.3. Mẫu rễ cây sâm cau được nghiền nhỏ
2.2.2.Phương pháp xác định độ ẩm
Nguyên tắc
Dùng sức nóng làm bay hơi hết hơi nước trong mẫu. Cân trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong mẫu.
Dụng cụ và thiết bị
Tủ điều chỉnh nhiệt độ (1000C – 1050C).
Cân phân tích, bình hút ẩm phía dưới để chất hút ẩm (silicagel). Chén sứ có nắp kín, đũa thuỷ tinh.
Cách tiến hành
Cân khối lượng m0 của chén sứ. Cân 5 mẫu bột rễ, mỗi mẫu có khối lượng m1 (5g) cho vào 5 chén sứ, dùng đũa thuỷ tinh dàn đều thành lớp mỏng. Cho tất cả vào tủ sấy ở 100 – 1030C. Sấy trong khoảng 5h. Sấy xong lấy mẫu ra khỏi tủ, làm nguội trong bình hút ẩm (20 – 25 phút). Cân và ghi lại khối lượng.
Cho lại vào tủ sấy 100 – 1030C trong 1h. Lặp lại cho đến khi khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp không quá 0,005g. Lúc này cân cả mẫu và chén, ghi
lại khối lượng m2.
Tính toán kết quả
Độ ẩm phần trăm được tính theo công thức:
𝑊(%) = (m₀ + m₁) − m₂ m₂ 𝑥 100 WTB (%) = ∑ 𝑊(%)31 5 Trong đó: m₀ : khối lượng chén sứ (g).
m₁ : khối lượng bột thân rễ sâm cau già/non (g).
m₂ : khối lượng chén sứ và bột thân rễ sâm cau già/non sau khi sấy (g). W(%) : độ ẩm của mỗi mẫu.
WTB(%): độ ẩm trung bình.
2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng tro
Nguyên tắc
Phá huỷ hợp chất hữu cơ bằng cách nung ở nhiệt độ 5250C ± 250C đến khối lượng không đổi.
Dụng cụ và thiết bị
- Lò nung. - Cân phân tích.
- Bình hút ẩm phía dưới để chất hút ẩm (silicagel). - Chén sứ.
Cách tiến hành
Cân 5g thân rễ sâm cau già/non vào 5 chén sứ. Cho tất cả vào lò nung ở nhiệt độ 5250C ± 250C. Nung trong khoảng 5h. Nung xong lấy mẫu ra khỏi lò, làm nguội trong bình hút ẩm (20 – 25 phút). Cân và ghi lại khối lượng.
Cho lại vào lò và nung ở 5250C ± 250C trong 1 giờ. Lặp lại cho đến khi khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp không quá 0,001g.
Tính toán kết quả H(%) = m₂−m₀ m₁−m₀𝑥 100% HTB(%) = ∑ 𝐻(%)31 5 Trong đó: m₀: khối lượng chén sứ (g).
m₁: khối lượng chén sứ và bột thân rễ sâm cau già/non trước khi tro hóa(g).
m₂: khối lượng chén sứ và bột thân rễ sâm cau già/non sau khi tro hóa (g). H(%): hàm lượng tro.
HTB(%): hàm lượng tro trung bình.
2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng kim loại
Nguyên tắc
Mẫu được vô cơ hoá và đo trên máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS.
Dụng cụ và thiết bị
- Lò nung, máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS - Bình định mức, pipet, chén nung…
Hóa chất
- Axit nitric đặm đặc. - Axit clohidric.
Cách tiến hành
Cân khoảng 6g (chính xác đến 0.001g) thân rễ sâm cau già/non cho vào chén nung. Đặt chén mẫu vào lò nung ở nhiệt độ < 1000C, nâng từ từ nhiệt độ đến 4500C, giữ nhiệt độ này trong khoảng 6-8 giờ.
Lấy chén nung ra khỏi lò nung, làm nguội đến nhiệt độ phòng, nếu tro chưa trắng thì thêm vào mẫu 1-2ml dung dịch HNO3 0.1M, đưa vào lò nung, tiếp tục đun đến tro trắng.
Hoà tan cặn bằng 15ml HNO3 0,1M, chuyển mẫu vào bình định mức 25ml, định mức đến vạch bằng dung dịch HNO3 0,1M. Dung dịch này dùng để đo trên máy AAS.
Tính toán kết quả
X = C x V m x K
Trong đó:
X: hàm lượng kim loại trong mẫu (mg/kg) (μg/kg)
C: hàm lượng kim loại đo được trên thiết bị (mg/L) (μg/L) V: thể tích định mức (ml)
K: hệ số pha loãng nếu có.
2.2.5. Phương pháp chiết soxhlet
Nguyên liệu là rễ cây sâm cau đã được nghiền nhỏ tiến hành chiết soxhlet lần lượt với từng loại dung môi có độ phân cực khác nhau như n- hexan, diclometan, etyl axetat, metanol. Cân chính xác lượng mẫu cần chiết gói vào giấy lọc, sau đó cho vào bộ chiết soxhlet gồm một bình cầu, một thiết bị chiết và một sinh hàn hồi lưu như Hình 2.5.
2.2.6. Khảo sát thời gian chiết
Khảo sát thời gian chiết tốt nhất với dung môi n-hexan
Lấy 5 mẫu bột thân rễ sâm cau già/non (khoảng 10 gam/1 mẫu), cân chính xác lượng mẫu bột lấy được. Khối lượng mẫu bột này là m. Sau đó, cho mẫu bột đã được cân chính xác này vào bộ chiết soxhlet với 150ml n-hexan. Tiến hành chiết ở nhiệt độ sôi của dung môi trong các khoảng thời gian khác nhau: 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ, 14 giờ, 16 giờ.
Cô quay chân không các dịch chiết đến khi còn lại nhỏ hơn 50 ml dịch chiết.
Cân khối lượng của bình tỉ khối m1. Cho dịch chiết vừa thu được vào rồi thêm dung môi đến vạch 50ml, đem cân được khối lượng m2.
Sau đó đổ dịch chiết ra cho dung môi vào, đem cân được khối lượng m3. Lập tỉ số % cao chiết = (m2 - m3) : m của dịch chiết. Sau đó, so sánh để tìm được thời gian chiết tối ưu.
Khảo sát thời gian chiết tốt nhất với dung môi diclometan
Lấy 5 mẫu bột thân rễ sâm cau già/non (khoảng 10 gam/1 mẫu), cân chính xác lượng mẫu bột lấy được. Khối lượng mẫu bột này là m. Sau đó, cho mẫu bột đã được cân chính xác này vào bộ chiết soxhlet với 150ml diclometan. Tiến hành chiết ở nhiệt độ sôi của dung môi trong các khoảng thời gian khác nhau: 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ, 14 giờ, 16 giờ.
Cô quay chân không các dịch chiết đến khi còn lại nhỏ hơn 50 ml dịch chiết.
Cân khối lượng của bình tỉ khối m1. Cho dịch chiết vừa thu được vào rồi thêm dung môi đến vạch 50ml, đem cân được khối lượng m2.
Sau đó đổ dịch chiết ra cho dung môi vào, đem cân được khối lượng m3. Lập tỉ số % cao chiết = (m2 - m3) : m của các dịch chiết. Sau đó, so sánh để tìm được thời gian chiết tối ưu.
Khảo sát thời gian chiết tốt nhất với dung môi etyl axetat
Lấy 5 mẫu bột thân rễ sâm cau già/non (khoảng 10 gam/1 mẫu), cân chính xác lượng mẫu bột lấy được. Khối lượng mẫu bột này là m. Sau đó, cho mẫu bột đã được cân chính xác này vào bộ chiết soxhlet với 150ml etyl axetat. Tiến hành chiết ở nhiệt độ sôi của dung môi trong các khoảng thời gian khác nhau: 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ, 14 giờ, 16 giờ. Cô quay chân không các dịch chiết đến khi còn lại nhỏ hơn 50 ml dịch chiết.
Cân khối lượng của bình tỉ khối m1. Cho dịch chiết vừa thu được vào rồi thêm dung môi đến vạch 50ml, đem cân được khối lượng m2.
Sau đó đổ dịch chiết ra cho dung môi vào, đem cân được khối lượng m3. Lập tỉ số % cao chiết = (m2 - m3) : m của các dịch chiết. Sau đó, so sánh để tìm được thời gian chiết tối ưu.
Khảo sát thời gian chiết tốt nhất với dung môi metanol
Tiến hành chiết nguyên liệu với dung môi metanol tương tự như với các dung môi n-hexan, diclometan, etyl axetat.
Phương pháp GC – MS xác định thành phần các hợp chất từ dịch chiết thân rễ sâm cau
Cân 10g bột thân rễ sâm cau già/non đã được xử lý cho vào giấy lọc, gói cẩn thận rồi cho vào bộ soxhlet 500ml. Chiết lần lượt khoảng 150ml với các dung môi n-hexan, diclometan, etyl axetat và metanol trong thời gian thích hợp thu được dịch chiết. Thu hồi dung môi trong dịch chiết ta thu được cao chiết. Cho cao chiết vào lọ thủy tinh, đậy nắp kĩ. Mẫu cao chiết từ rễ cây sâm cau này được xác định thành phần bằng phương pháp GC – MS ở Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng II, số 2 – Ngô Quyền – Đà Nẵng.
2.2.7. Quy trình thực nghiệm
Toàn bộ quy trình thực nghiệm được thể hiện khái quát trong sơ đồ ở Hình 2.6.
Hình 2.5. Sơ đồ quy trình thực nghiệm
Thân rễ cây sâm cau (già và non)
Rửa sạch, hong khô
Cắt nhỏ Xác định độ ẩm của rễ tươi Sấy khô Xay bột mịn Chiết soxhlet Xác định hàm lượng tro, thành phần kim loại. Dịch chiết (dung môi etylaxetat) 2 mẫu Dịch chiết (dung môi n-hexan) 2 mẫu Dịch chiết (dung môi diclometan) 2 mẫu Dịch chiết (dung môi metanol) 2 mẫu
Chọn dịch chiết ứng với thời gian chiết tốt nhất
Đo GC-MS
Định danh thành phần (8 mẫu)
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC THÔNG SỐ HÓA LÝ 3.1.1. Độ ẩm của rễ cây sâm cau 3.1.1. Độ ẩm của rễ cây sâm cau
Độ ẩm của rễ già:
Bằng phương pháp trọng lượng, độ ẩm của rễ già được đo và trình bày ở Bảng 3.1 và Bảng 3.2.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát độ ẩm của rễ già tươi
Mẫu m₀ (g) m₁ (g) m₂ (g) W (%) WTB (%) 1 30,270 4,977 32,328 58,650 58,894 2 30,462 5,247 32,573 59,767 3 29,805 5,021 31,872 58,833 4 32,595 5,101 34,690 58,930 5 29,784 5,234 31,967 58,292
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ ẩm rễ già khô
Mẫu m₀ (g) m₁ (g) m₂ (g) W (%) WTB (%) 1 30,272 5,011 34,839 8,861 8,845 2 30,462 5,102 35,115 8,800 3 29,823 5,084 34,452 8,950 4 32,613 5,198 37,356 8,753 5 29,796 5,113 34,456 8,860
Nhận xét: Kết quả cho thấy độ ẩm trung bình của thân rễ sâm cau già tươi và khô lần lượt là 58,984% và 8,845%. Độ ẩm trong mẫu nguyên liệu tươi tương đối cao và cao hơn rất nhiều so với độ ẩm trong mẫu khô. Vì vậy,
để hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật, nguyên liệu cần được sấy khô. Như vậy sẽ thuận lợi cho việc bảo quản nguyên liệu trong thời gian dài mà không bị mốc.
Độ ẩm của rễ non:
Bằng phương pháp trọng lượng, độ ẩm của rễ non được đo và thể hiện ở Bảng 3.3 và Bảng 3.4.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ ẩm của rễ non tươi
Mẫu m₀ (g) m₁ (g) m₂ (g) W (%) WTB (%) 1 30,270 5,036 31,377 78,018 78,357 2 30,462 5,182 31,585 78,329 3 29,805 5,022 30,877 78,654 4 32,595 5,189 33,714 78,435 5 29,784 5,242 30,919 78,348
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ ẩm của rễ non khô
Mẫu m₀ (g) m₁ (g) m₂ (g) W (%) WTB (%) 1 30,278 5,071 34,998 6,922 6,863 2 30,460 5,092 35,209 6,736 3 29,820 5,012 34,486 6,910 4 32,612 5,023 37,293 6,816 5 29,793 5,032 34,476 6,932
Nhận xét: Độ ẩm trung bình của thân rễ sâm cau non tươi và khô lần lượt là 78,357% và 6,863%. Độ ẩm trong mẫu nguyên liệu tươi tương đối cao và cao hơn rất nhiều so với độ ẩm trong mẫu khô. Vì vậy, để hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật, nguyên liệu cần được sấy khô. Như vậy sẽ thuận lợi cho việc bảo quản nguyên liệu trong thời gian dài mà không bị mốc.
3.1.2.Hàm lượng tro trong rễ cây sâm cau
Hàm lượng tro của rễ già:
Bằng phương pháp trọng lượng, hàm lượng tro của thân rễ sâm cau già được đo và thể hiện ở Bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát hàm lượng tro trong thân rễ sâm cau già
Mẫu m₀ (g) m₁ (g) m₂ (g) H (%) HTB (%) 1 30,270 35,247 30,395 2,502 2,466 2 30,462 35,709 30,589 2,424 3 29,805 34,826 29,928 2,450 4 32,595 37,696 32,721 2,470 5 29,784 35,018 29,914 2,484
Nhận xét: Hàm lượng tro trung bình của thân rễ sâm cau già là 2,466%. Đây là hàm lượng các chất vô cơ không bay hơi tồn tại trong rễ cây sâm cau. Từ Bảng 3.5 cho thấy trong thân rễ sâm cau già chứa một lượng các chất vô cơ, trong đó có thể có mặt muối của một số kim loại. Do điều kiện thổ nhưỡng ở những vùng khác nhau, thành phần các chất vô cơ trong cây sẽ khác nhau.
Hàm lượng tro của rễ non:
Bằng phương pháp trọng lượng, hàm lượng tro của thân rễ sâm cau non được đo và thể hiện ở Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát hàm lượng tro trong thân rễ sâm cau non
Mẫu m₀(g) m₁(g) m₂(g) H (%) HTB (%) 1 30,278 34,998 30,426 3,136 2,993 2 30,460 35,209 30,593 2,801 3 29,820 34,486 29,964 3,086 4 32,612 37,293 32,749 2,930 5 29,793 34,476 29,934 3,013
Nhận xét: Hàm lượng tro trung bình của thân rễ sâm cau non là 2,993%. Từ Bảng 3.6 cho thấy trong thân rễ sâm cau non chứa một lượng các chất vô cơ, trong đó có thể có mặt muối của một số kim loại.
3.1.3.Hàm lượng kim loại trong rễ cây sâm cau
Hàm lượng kim loại trong rễ già:
Hàm lượng một số kim loại trong thân rễ sâm cau già được xác định bằng phương pháp đo AAS. Kết quả được tổng hợp ở Bảng 3.7.
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát hàm lượng kim loại trong thân rễ sâm cau già
Mẫu Tên kim loại Phương pháp thử Hàm lượng (mg/l) Kết quả (mg/kg) Hàm lượng cho phép (mg/kg) 1 Hg TCVN 6626: 2000 0 0 01 2 As TCVN 6193:1996 0,0071 0,1180 01 3 Cu TCVN 6626: 2000 0,1400 2,3210 30 4 Pb TCVN 6626: 2000 0,1200 0,1190 02 5 Cd TCVN 6626: 2000 0,0002 0,0039 01 6 Zn TCVN 6626: 2000 0,8100 18,4330 40
Nhận xét: Căn cứ vào tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) cho thực phẩm (theo quyết định của bộ y tế số 505/BYT-QĐ ngày 13 tháng 4 năm 1992) về hàm lượng kim loại nặng tối đa cho phép trong rau quả sấy khô, cho thấy hàm lượng kim loại nặng có trong thân rễ sâm cau già từ kết quả thực nghiệm ở Bảng 3.7 thấp hơn nhiều so với hàm lượng tối đa cho phép. Đây là hàm lượng an toàn, không gây hại cho cơ thể. Vì vậy có thể sử dụng thân rễ sâm cau già trong dược liệu, không ảnh hưởng đến sức khoẻ con người.
Hàm lượng kim loại trong rễ non:
phương pháp đo AAS. Kết quả xác định hàm lượng kim loại nặng được tổng hợp ở Bảng 3.8. Đây là một trong những chỉ số quan trọng để đánh giá việc sử dụng rễ cây sâm cau làm dược liệu có an toàn hay không. Vì nguyên liệu có thể bị nhiễm một số kim loại gây hại cho cơ thể con người từ môi trường đất, nước,…
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát hàm lượng kim loại trong thân rễ sâm cau non
Mẫu Tên kim loại Phương pháp thử Hàm lượng (mg/l) Kết quả (mg/kg) Hàm lượng cho phép (mg/kg) 1 Hg TCVN 6626: 2000 0 0 01 2 As TCVN 6193:1996 0,0070 0,1160 01 3 Cu TCVN 6626: 2000 0,1700 2,8180 30 4 Pb TCVN 6626: 2000 0,1600 0,1590 02 5 Cd TCVN 6626: 2000 0,0024 0,0042 01 6 Zn TCVN 6626: 2000 0,8300 13,7640 40
Nhận xét: Căn cứ vào tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) cho thực phẩm (theo quyết định của bộ y tế số 505/BYT-QĐ ngày 13 tháng 4 năm 1992) về hàm lượng kim loại nặng tối đa cho phép trong rau quả sấy khô, cho thấy hàm lượng kim loại nặng có trong thân rễ sâm cau non thấp hơn nhiều so với hàm lượng tối đa cho phép. Đây là hàm lượng an toàn, không gây hại cho cơ thể.