a. Chuẩn bị m u
Mẫu c c hợp chất này đƣợc pha thành dung dịch gốc với nồng 100 mg/ml (đối với cặn chiết) hoặc 100 mM (đối với chất sạch) trong DMSO, sau đó pha loãng ở c c nồng độ kh c nhau.
b. Phương pháp tiến hành đánh giá hoạt tính kháng viêm
Tế bào RAW264.7 đƣợc nuôi cấy 48 giờ trong môi trƣờng DMEM ở 37oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin và streptomycin sulphate. Sau đó chúng đƣợc nuôi
cấy trong giếng phiến 96 với mật độ 2.5 x 105 tế bào/giếng. Tế bào đƣợc kích thích với 2µL LPS (0.1mg/mL) trong 24 giờ với sự có mặt của các hợp chất thử ở nhiều nồng độ kh c nhau, đƣợc pha sẵn trong DMSO. Dịch nổi của tế bào phản ứng với thuốc thử Griess.NaNO2 ở các nồng độ kh c nhau đƣợc sử dụng để xây dựng đƣờng chuẩn. Độ hấp thụ đƣợc đo ở 570 nm. Cardamonin đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng [30], [31].
Phần tế bào còn lại sau khi đã sử dụng để đ nh gi c c hoạt tính invitro đƣợc bổ sung dung dịch MTT (0.5mg/ml pha trong PBS), ủ 4h ở 37oC và 5% CO2. Sau đó hút bỏ hết môi trƣờng trên bề mặt, kết tủa formazan đƣợc hòa tan trong isopropanol. Độ hấp thụ đƣợc đo ở 570 nm.
* Tính kết quả
- Tính % ức chế NO
%UC =([Xtb](mẫu thử)-[Xtb]LPS)/([Xtb]Control-[Xtb]LPS)*100
Trong đó: [Xtb] : nồng độ NO trung bình, đƣợc tính toán dựa vào đƣờng chuẩn NaNO2
- Tính giá trị CS % (% Cell Survival)
Giá trịCS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử, Giá trị CS (%) đƣợc tính theo công thức:
Trong đó: OD: mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn σ đƣợc tính theo công thức:
Trong đó: xi: gi trị OD tại giếng i; x : gi trị OD trung bình n: số giếng thử lặp lại
Nồng độ ức chế 50%, IC50 đƣợc xây dựng trên 5 nồng độ thử nghiệm. Giá trị IC50 đƣợc x c định theo phƣơng ph p hồi quy tuyến tính trên phần mềm Graphpad Prism 5.0.
c. Phương pháp tiến hành đánh giá độc tế bào
Tế bào đƣợc nuôi cấy 48 giờ trong môi trƣờng RPMI 1640 hoặc DMEM ở 37oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin (100 units/mL) và streptomycin sulphate (100µg/mL). Sau đó chúng đƣợc nuôi cấy trong giếng phiến 96 với thể tích là 200 µl, mật độ 2-5 x 105 tế bào/giếng (tuỳ từng loại tế bào). Sau 24 giờ, chúng đƣợc thử với hợp chất pha sẵn ở các nồng độ khác nhau trong DMSO. Sau 72h, cho phản ứng với 0.5 mg/mL µl MTT, ủ 4h ở 37oC và 5% CO2. Sau đó hút bỏ hết môi trƣờng trên bề mặt, kết tủa formazan đƣợc hòa tan trong isopropanol. Độ hấp thụ đƣợc đo ở 570nm. Camptothecin đƣợc sử dụng làm đối chứng dƣơng.
*Tính kết quả
Tính giá trị CS % (% Cell Survival)
Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử, mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% thì đƣợc đ nh gi là có hoạt tính.
Giá trị CS (%) đƣợc tính theo công thức:
Trong đó: OD: mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn σ đƣợc tính theo công thức:
Trong đó: xi: gi trị OD tại giếng i; x : gi trị OD trung bình n: số giếng thử lặp lại
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS ≤ 50% ± σ) sẽ đƣợc chọn ra cho thử nghiệm bƣớc tiếp theo hòa tan trong isopropanol. Độ hấp thụ đƣợc đo ở 570 nm.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});