Phân lập là t ch riêng một chất dƣới dạng tinh khiết ra khỏi một hỗn hợp. Thành phần của một dƣợc liệu thƣờng rất phức tạp, trong nhiều trƣờng hợp, chỉ một hoặc vài chất trong hỗn hợp toàn phần của dƣợc liệu đƣợc sử dụng làm thuốc. Để t ch riêng hoạt chất hoặc trong nghiên cứu muốn t ch riêng c c chất để x c định cấu trúc, làm chất chuẩn, nghiên cứu dƣợc lý... ngƣời ta cần tiến hành phân lập từng chất dƣới dạng tinh khiết [11].
Có nhiều phƣơng ph p đƣợc sử dụng để phân lập c c chất từ một hỗn hợp. Có c c phƣơng ph p kinh điển nhƣ c c phƣơng ph p kết tinh phân đoạn, chƣng cất phân đoạn hay c c kỹ thuật sắc ký hiện đại v.v... Một số kỹ thuật sắc ký đặc trƣng cho phân lập c c chất thƣờng sử dụng trong nghiên cứu dƣợc liệu: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo s t), sắc ký cột thƣờng (CC), sắc ký cột pha đảo.
a. Kĩ thuật sắc kí lớp mỏng
* Sắc ký lớp mỏn (thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc ký đƣợc dùng để t ch c c chất trong hỗn hợp. Phƣơng ph p sắc ký lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng c c chất hấp phụ, thƣờng là silica gel, aluminium
oxit, đƣợc phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích đƣợc hòa tan trong một dung môi thích hợp và đƣợc hút lên bản sắc ký bởi mao dẫn, t ch dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của c c thành phần trong dung dịch [11], [12], [19].
- Đại lƣợng đặc trƣng quan trọng về mức độ t ch là hệ số di chuyển Rf đƣợc tính bằng tỉ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:
R =f a b
Trong đó:
a là khoảng c ch từ điểm xuất ph t đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm. b là khoảng c ch từ điểm xuất ph t đến mực dung môi đo trên cùng đƣờng đi của vết, tính bằng cm.
Rf chỉ có gi trị từ 0 đến 1.
Khi Rf bằng 0 thì chất tan hoàn toàn không di chuyển, còn khi Rf bằng 1 thì chất tan di chuyển bằng tốc độ của dung môi.
- Có nhiểu yếu tố ảnh hƣởng đến Rf nhƣng quan trọng là: + Chất lƣợng và hoạt tính chất hấp phụ (loại bản mỏng). + Bề dày của lớp mỏng.
+ Chất lƣợng và độ tinh khiết của pha động.
+ Lƣợng mẫu chấm lên bản nhiều hay ít cũng làm vị trí của vết trên bản thay đổi.
* Lựa chọn dung môi chạy cột sắc kí
Dung môi thích hợp dùng trong sắc ký lớp mỏng sẽ là một dung môi có tính phân cực kh c với pha tĩnh. Nếu một dung môi phân cực đƣợc dùng để hòa tan mẫu thử trên một pha tĩnh phân cực, vệt nhỏ mẫu thử sẽ lan tròn do mao dẫn, và c c vệt kh c nhau có thể trộn lẫn vào nhau. Do đó, để hạn chế sự lan tròn của c c vệt mẫu, dung môi đƣợc sử dụng để hòa tan mẫu thử phải không phân cực, hoặc phân cực một phần, nếu pha tĩnh phân cực, và ngƣợc lại.
Để lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy cột sắc kí silica gel dựa vào sắc kí bản mỏng với c c bƣớc sau:
- Hòa tan một lƣợng nhỏ cao chiết trong dung môi Chloroform.
- Chuẩn bị một số bản mỏng rồi dùng ống mao quản chấm dung dịch mẫu lên trên mỗi tấm với lƣợng tƣơng đƣơng nhau.
- Mỗi bản mỏng đƣợc chạy với c c dung môi và hệ dung môi có độ phân cực kh c nhau nhƣ: Cloroform, Axeton, Dietyl ete, Etyl axetat, Axit axetic, Cloroform/ Etyl axetat, Axeton/ Etyl axetat,...với c c tỉ lệ kh c nhau (khi thử với hệ dung môi).
*Các t ến àn
Sắc ký lớp mỏng đƣợc thực hiện trên bản mỏng tr ng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Dung môi triển khai sắc ký là hỗn hợp của một số trong số c c dung môi thƣờng dùng nhƣ n-hexan, cloroform, etyl axetat, axeton, metanol và nƣớc. Ph t hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch vanilin H2SO4 10% đƣợc phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu.
Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bƣớc sóng 254 nm và 368 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng nhƣ cũ để x c định vùng chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ thu đƣợc chất cần tinh chế.
b. Kĩ thuật sắc kí cột
Sắc ký cột là phƣơng ph p dùng để t ch c c chất (cấu tử) ra khỏi hỗn hợp dựa vào tính phân cực của từng chất [11], [12], [19].
Nguyên lí tách: một mẫu thử đƣợc nạp lên một cột chứa chất hấp phụ. Cột chứa chất hấp phụ này đóng vai trò là một pha tĩnh. Một dung môi triển khai (pha động) di chuyển dọc theo cột sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử, do các cấu tử này có độ phân cực khác nhau nên ái lực của chúng với pha tĩnh cũng kh c nhau, vì vậy chúng bị dung môi giải hấp và bị đẩy đi với vận tốc khác nhau tạo ra các dải
riêng biệt có vị trí khác nhau ra khỏi cột tại các thời điểm kh c nhau , làm cơ sở cho việc phân tích.
* Lựa chọn chất hấp ph và dung môi chạy cột sắc kí
Thông thƣờng sử dụng chất hấp phụ là silica gel, ngoài ra còn dùng Sephadex, c c chất hấp phụ không có khả năng trƣơng nở nhƣ Al2O3, CaCO3.
Đặc điểm của silica gel: Silica gel làm pha tĩnh trong sắc kí đƣợc chế tạo bằng c ch thủy giải Natrisilicat (cho t c dụng với acid sunfuric) để thành acid polysilisic, tiếp theo là sự ngƣng tụ và polymer hóa để đạt c c chỉ tiêu vật lí cần thiết nhƣ có c c hạt với kích cỡ hạt, thể tích lốc rỗng trên bề mặt, diện tích bề mặt...nhƣ yêu cầu.
* Cách nạp silica gel vào cột
Cột đƣợc rửa sạch, tr ng nƣớc cất và sấy khô, gắn trên một gi đỡ vững chắc. Để việc t ch chất đƣợc tốt, silica gel phải đƣợc nạp vào cột một c ch đồng nhất để hạn chế việc “nứt” cột, bất thƣờng. Silica gel đƣợc nạp vào cột theo hai c ch:
- Nạp s l ca el ở dạn sệt
• Cố định cột thẳng đứng trên gi . Nếu phần đầu ra của cột không có lớp thủy tinh xốp thì ta cho một lớp bông mỏng vào đ y để ngăn không cho silica gel chảy xuống bình hứng.
• Cho dung môi chạy cột vào bình đựng (cốc, chai). Cân lƣợng silica gel cần thiết (đã tính to n x c đinh ở trên) cho vào bình đựng đều đặn, mỗi lần một lƣợng nhỏ, khuấy đều. Lƣu ý không đƣợc thực hiện ngƣợc lại, nghĩa là rót dung môi vào silica gel bởi vì silica gel gặp dung môi sẽ ph t nhiệt, có thể làm vón cục, không đồng nhất.
• Lƣợng dung môi phải vừa đủ để hỗn hợp không đƣợc qu sệt khiến cho bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng không đƣợc qu lỏng.
• Rót hỗn hợp sệt vào cột qua một phễu lọc đuôi dài và mở nhẹ khóa để dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục đƣợc dùng để rót trở lại đầu cột).
• Tiếp tục rót hỗn hợp vào cột đến hết số lƣợng, vừa rót vừa gõ nhẹ thành cột bằng thanh cao su để silica gel nén đều trong cột.
• Sau khi nạp xong cho dung môi chảy đều qua cột vài ba lần để việc nạp cột đƣợc chặt chẽ và trong cột đƣợc đồng nhất. Lƣu ý trong qu trình nạp cột, nhất thiết không đƣợc để cho đầu cột bị khô, nghĩa là luôn luôn có dung môi phủ trên phần đầu cột.
• Sau khi kết thúc qu trình nạp xong, mặt tho ng silica gel phải phẳng. Nếu mặt tho ng chƣa phẳng , phải cho dung môi thêm cao lên trên phần đầu cột rồi dùng đũa thủy tinh khuấy đảo nhẹ phần dung môi s t mặt tho ng, làm x o trộn một phần silica gel ở trên đầu cột, để yên cho silica gel lắng xuống từ từ tạo nên mặt tho ng bằng phẳng.
• Với sắc kí cột Sephadex ta thao t c tƣơng tự nhƣng cần ngâm Sephadex với dung môi một thời gian để Sephadex trƣơng nở trƣớc khi cho vào cột.
- Nạp s l ca el dạn k ô
•Cột đƣợc giữ thẳng đứng trên gi . Cho miếng bông nhỏ vào đ y cột (nếu cột không có lớp thủy tinh xốp).
•Rót dung môi chạy cột vào khoảng hai phần ba cột. Cho từ từ silica gel dạng khô vào cột qua phễu lọc, vừa cho vừa gõ nhẹ thành cột.
•Sau khi nạp silica gel xong, cho dung môi chảy qua vài lần đến khi đuổi hết bọt khí trong cột để cột đƣợc ổn định trƣớc khi nạp mẫu vào.
•Thông thƣờng ngƣời ta nạp silica gel vào cột ở dạng sệt.
* Cách nạp mẫu vào cột
Có hai phƣơng ph p nạp mẫu vào cột sắc kí sau: - Phƣơng ph p khô
•Nếu mẫu chất không tan hoặc tan kém trong dung môi lựa chọn để bắt đầu qu trình sắc kí cột, vì đây là loại dung môi kém phân cực, thay vì phải hòa tan mẫu trong dung môi phân cực (có thể ảnh hƣởng đến qu trình giải li) có thể nạp mẫu khô.
•Hòa tan hoàn toàn mẫu trong dung môi thích hợp, cho một lƣợng silica gel vừa đủ (lƣợng silica gel cho vào càng ít càng tốt nhƣng phải đủ để có thể cô quay mẫu đƣợc khô hoàn toàn) vào rồi đem cất quay cô đuổi dung môi đến khô hoàn toàn. Lấy mẫu đã gắn đều trên silica gel ra, nghiền thành bột thật mịn.
•Cột sau khi nạp silica gel đƣợc điều chỉnh với lƣợng dung môi vừa đủ (đủ thấm ƣớt mẫu khô cho vào). Mẫu khô đã đƣợc làm tơi mịn đƣợc cho vào cột sắc kí từ từ thông qua phễu sau khi đã kho cột. Chú ý khi cho mẫu vào cột theo phƣơng ph p khô thì lƣợng dung môi phải vừa đủ, không nhiều qu ; lƣợng mẫu phải dàn trải đều một lớp mỏng trên bề mặt silica gel trong cột; mẫu phải thấm ƣớt đều dung môi, không có bọt khí. Cho một lớp silica gel vào đầu cột để bảo vệ bề mặt. Cuối cùng, cho dung môi giải li vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly [].
- Phƣơng ph p ƣớt
•Thƣờng áp dụng khi mẫu tan hoàn toàn trong dung môi chạy cột ban đầu. •Lƣợng dung môi dùng hoà tan mẫu càng ít càng tốt, vì lớp dung dịch này sẽ dàn trải một lớp mỏng trên cột. Có thể áp dụng tính toán cụ thể nhƣ sau: thể tích dung môi cần lấy để hoà tan mẫu = 0,4.d2ml, với d là đƣờng kính trong của cột tính bằng mm.
• Mẫu đƣợc cho trực tiếp vào cột bằng ống hút mẫu (pipet). Cho mẫu chảy vào từ từ theo thành cột.
•Với phƣơng ph p nạp mẫu này chúng ta cho dung môi trong cột chảy xuống sát bề mặt silica gel trong cột rồi khoá cột. Sau đó, mở kho để mẫu chảy xuống đến sát bề mặt silica gel. Cho từng lƣợng nhỏ dung môi chạy cột vào để mẫu chảy qua bề mặt silica gel trong cột và rửa sạch thành cột rồi tiến hành chạy cột (để lớp mẫu chất chảy xuống đồng đều).