CHIẾT CÂY BỒ CÔNG ANH BẰNG CÁC DUNG MÔI
3.2.1. Kết quả x c định thành phần h a học trong dịch chiết bằng dung môi n-hexan
Dịch chiết thu đƣợc khi chiết lắc cao tổng metanol của bột cây bồ công anh bằng dung môi n-hexan có màu xanh thẫm đƣợc bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng, lọc bỏ cặn bẩn và gửi đi đo GC-MS. Dịch chiết n-hexan từ cây bồ công anh đƣợc x c định thành phần hóa học bằng phƣơng ph p GC-MS, sắc kí đồ đƣợc thể hiện ở Hình 3.1 và kết quả định danh thành phần hóa học đƣợc tổng hợp ở Bảng 3.4.
Bản 3.4. Kết quả địn dan t àn p ần óa ọc và côn t ức cấu tạo tươn ứn tron dịc c ết n-hexan từ cây bồ côn an
STT Tên gọi Diện tích peak (%)
Thời gian lƣu
Công thức cấu tạo
1 2(5H)- Furanone 0.86 5.266 O O 2 2,5- Furandicarbonxaldehyde 2.18 7.871 O O H H O 3 Phenol, 2-methoxy- 2.74 8.089 OCH3 OH 4 4H- Pyran-4-one,2,3- dihydro-3,5-dihydroxy- 6-methyl- 8.38 9.043 O O OH O H Me 5 Coumaran 4.76 10.159 O 6 5- Hydroxymethylfurfural 24.57 10.480 O O H O H
STT Tên gọi Diện tích peak (%)
Thời gian lƣu
Công thức cấu tạo
7 Ethanone, 1-(2-hydroxy- 5- methylphenyl)- 11.50 11.632 O H O 8 Phenol, 2,6- dimethoxy- 7.05 12.144 O CH3 O C H3 OH 9 (3-Nitrophenyl)
methanol, n-propyl ether 19.56 13.487 O
N+ - O O 10 Octadecanoic acid 2.22 21.557 O O H 11 Isoshyobunone 2.61 21.837 O 12 Nookatone 5.53 22.223 O
STT Tên gọi Diện tích peak (%)
Thời gian lƣu
Công thức cấu tạo
13 Aristolene epoxide 1.18 22.484 O 14 Methyl Camphorsulfonates 2.50 23.980 O S O O O 15 Dehydroxy- isocalamendiol 4.36 24.891 OH Nhận xét:
Từ kết quả ở Bảng 3.4 cho thấy phƣơng pháp GC-MS đã định danh đƣợc 15 cấu tử trong dịch chiết n-hexan từ cây bồ công anh. Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexan chủ yếu là những cấu tử phân cực bao gồm c c dẫn xuất phenol, ete thơm và c c cấu tử đều có hàm lƣợng kh cao.
Các cấu tử có hàm lƣợng cao nhƣ: 5-Hydroxymethylfurfural (24.57%), (3-Nitrophenyl) methanol, n-propyl ether (19.56%), Ethanone, 1-(2-hydroxy- 5- methylphenyl)- (11,5%), 4H- Pyran-4-one,2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl- (8.38%), Phenol, 2,6- dimethoxy- (7.05%), còn lại các cấu tử có hàm lƣợng thấp nhƣ: 2(5H)- Furanone (0.86%), Aristolene epoxide (1.18%), 2,5-
Furandicarbonxaldehyde (2.18%), Octadecanoic acid (2.22%), Methyl Camphorsulfonates (2.5%), Isoshyobunone (2.61%), Phenol, 2-methoxy- (2.74%), Dehydroxy- isocalamendiol (4.36%), Coumaran (4.76%), Nootkatone (5.53%).
Trong dịch chiết n-hexan từ cây bồ công anh có các chất có chứa hoạt tính sinh học rất cao, có ý nghĩa rất lớn trong thực tiễn. 5-Hydroxymethylfurfural (5 HMF) đã đƣợc xem xét để điều trị bệnh hồng cầu hình liềm, HMF còn đƣợc sử dụng trong công nghiệp thực phẩm dƣới hình thức là chất phụ gia, chất tạo hƣơng liệu [40]. Octadecanoic acid (Acid stearic) là một axít béo no, chất này hiện diện trong nhiều dầu mỡ động vật và thực vật nhƣng phổ biến hơn trong mỡ động vật hơn là trong dầu thực vật; trong các nghiên cứu dịch tễ học và lâm sàng, acid stearic đƣợc tìm thấy có liên quan đến giảm cholesterol LDL so với các axit béo bão hòa khác [42]. Ngoài ra, axit stearic đƣợc sử dụng chủ yếu trong sản xuất chất tẩy rửa, xà phòng, mỹ phẩm nhƣ dầu gội và sản phẩm cạo râu kem; este của axit stearic với ethylene glycol , glycol stearate và glycol distearat , đƣợc sử dụng để tạo ra một hiệu ứng ngọc trai trong dầu gội, xà phòng và các sản phẩm mỹ phẩm khác; axit stearic đƣợc sử dụng cùng với c c loại đƣờng đơn giản hoặc xi-rô ngô nhƣ một chất làm cứng trong kẹo; axit stearic đƣợc sử dụng để sản xuất bổ sung chất trong chế độ ăn uống.
3.2.2. Kết quả x c định thành phần h a học trong dịch chiết bằng dung môi diclometan
Dịch chiết thu đƣợc khi chiết lắc cao tổng metanol của bột cây bồ công anh bằng dung môi diclometan có màu xanh thẫm đƣợc bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng, lọc bỏ cặn bẩn và gửi đi đo GC-MS. Dịch chiết diclometan từ cây bồ công anh đƣợc x c định thành phần hóa học bằng phƣơng ph p GC-MS, sắc kí đồ đƣợc thể hiện ở Hình 3.2 và kết quả định danh thành phần hóa học đƣợc tổng hợp ở Bảng 3.5.
Hình 3.2. GC- S của dịc c ết diclometan từ cây bồ côn an
Bản 3.5. Kết quả địn dan t àn p ần óa ọc và côn t ức cấu tạo tươn ứn tron dịc c ết diclometan từ cây bồ côn an
STT Tên gọi Diện tích peak (%)
Thời gian lƣu
Công thức cấu tạo
1 E- 2- Tetradecen-1-ol 9.38 9.491 OH C H3 2 1-Allyl-1-but-3-enyl-1- silacyclobutane 52.03 16.85 Si 3 Decane, 5,6- bis (2,2- dimethylpropylidence) 11.16 20.409
STT Tên gọi Diện tích peak (%)
Thời gian lƣu
Công thức cấu tạo
H H 4 Adipic acid, 2,4- dimethylpent-3-yl nonyl ester 27.43 26.313 O O CH3 O O Nhận xét:
Kết quả ở Bảng 3.5 cho thấy phƣơng ph p GC-MS đã định danh đƣợc 4 cấu tử trong dịch chiết diclometan từ cây bồ công anh. Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexan chủ yếu là những hợp chất phân cực yếu đến không phân cực. Các chất hữu cơ chiếm hàm lƣợng cao là 1-Allyl-1-but-3-enyl-1-silacyclobutane (52.03%), Adipic acid, 2,4- dimethylpent-3-yl nonyl ester (27.43%), Decane, 5,6- bis (2,2- dimethylpropylidence) (11.16%), E- 2- Tetradecen-1-ol (9.38%).
3.2.3. Kết quả x c định thành phần h a học trong dịch chiết bằng dung môi etyl axetat
Dịch chiết thu đƣợc khi chiết lắc cao tổng metanol của bột cây bồ công anh bằng dung môi etyl axetat có màu rêu đƣợc bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng, lọc bỏ cặn bẩn và gửi đi đo GC-MS. Dịch chiết etyl axetat từ cây bồ công anh đƣợc x c định thành phần hóa học bằng phƣơng ph p GC-MS, sắc kí đồ đƣợc thể hiện ở Hình 3.3 và kết quả định danh thành phần hóa học đƣợc tổng hợp ở Bảng 3.6.
Hình 3.3. GC-MS của dịch chiết ethylacetat từ cây bồ công anh
Bảng 3.6. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết etyl axetat từ cây bồ công anh
STT Tên gọi Diện tích peak (%)
Thời gian lƣu
Công thức cấu tạo
1 Neophytadiene 5.9 9.484 2 1,1’- Bicyclohexyl, 4-propoxy- 4’- propyl- 4.04 14.221 O 3 1-Allyl-1-but-3- enyl-1- silacyclobutane 29.47 16.856
STT Tên gọi Diện tích peak (%)
Thời gian lƣu
Công thức cấu tạo
Si 4 Neophytadiene 2.97 18.252 5 Decane, 5,6- bis (2,2- dimethyl propylidence)- ,(E,Z)- 9.9 19.929 H H 6 4-t-Butyl- 2- (1- methyl-2-nitroethyl) cyclohexanone 14.13 20.411 O N+ O- O
7 Adipic acid, nonyl 2
– octyl ester 33.61 26.907 O
O O
O
Nhận xét:
Kết quả ở Bảng 3.6 cho thấy phƣơng ph p GC-MS đã định danh đƣợc 7 cấu tử trong dịch chiết etyl axetat từ cây bồ công anh. Thành phần hóa học trong dịch
chiết etyl axetat chủ yếu là những hợp chất không phân cực, đó là các hidrocacbon mạch dài, este. Các chất hữu cơ chiếm hàm lƣợng cao là Adipic acid, nonyl 2 – octyl ester (33.61%), 1-Allyl-1-but-3-enyl-1-silacyclobutane (29.47%), 4-t-Butyl- 2- (1-methyl-2-nitroethyl) cyclohexanone (14.13%), còn lại các cấu tử có hàm lƣợng thấp là Decane, 5,6- bis (2,2- dimethyl propylidence)-,(E,Z)- (9.9%), Neophytadiene (5.9% và 2.97%), 1,1’- Bicyclohexyl, 4-propoxy- 4’-propyl- (4.04%). Neophytadiene đƣợc đề xuất nhƣ là một thƣớc đo về sự đóng góp của terpenoids đối với khả năng gây ung thƣ của khói thuốc lá [45].
3.2.4. Tổng hợp x c định thành phần h a học của dịch chiết cây bồ công anh bằng c c dung môi
Phƣơng ph p GC-MS đã định danh đƣợc 23 cấu tử trong dịch chiết cây bồ công anh bằng c c dung môi kh c nhau; trong đó dịch chiết n-hexan có 15 cấu tử, dịch chiết diclometan có 4 cấu tử, dịch chiết etyl axetat có 6 cấu tử.
So với công trình đã nghiên cứu [18] thì số cấu tử định danh đƣợc trong dịch chiết cây bồ công anh bằng các dung môi ít hơn nhiều so với tổng số cấu tử định danh đƣợc từ dịch chiết rễ, lá cây bồ công anh. Cụ thể tác giả đã định danh đƣợc có 29 cấu tử trong cả dịch chiết rễ và lá bồ công anh bằng 4 dung môi (n-hexan, diclometan, etyl axetat, metanol), trong đó rễ cây bồ công anh phát hiện đƣợc 18 cấu tử, lá cây bồ công anh phát hiện đƣợc 20 cấu tử, có 3 cấu tử trùng lại trong cả dịch chiết rễ và lá cây bồ công anh bao gồm n-hexadecanoic acid, Phytol, Stigmasta-7, 16-dien-3-ol, (3.beta., 5. alpha.)- trong dó cấu tử có thành phần % cao nhất và lặp lại trong cả dịch chiết rễ và lá bằng 4 dung môi là Stigmasta-7, 16-dien- 3-ol, (3.beta., 5. alpha.)
Số lƣợng cấu tử định danh cũng nhƣ hàm lƣợng các cấu tử trong các dung môi khác nhau là khác nhau. Việc sử dụng dung môi ảnh hƣởng lớn đến việc chiết tách các cấu tử trong mẫu thực vật, ví dụ: khi dùng n- hexan thì dịch chiết từ cây bồ công anh định danh đƣợc đến 15 cấu tử, trong khi đó dùng diclometan thì chỉ định danh đƣợc 4 cấu tử. Điều này đƣợc giải thích là do khả năng hòa tan của các dung môi khác nhau là khác nhau; nó phụ thuộc mức độ phân cực của dung môi, đƣợc
biểu thị qua hằng số điện môi. Dung môi phân cực có hằng số điện môi lớn, dung môi càng kém phân cực có hằng số điện môi càng nhỏ.
Kết quả tổng hợp định danh các cấu tử có trong dịch chiết cây bồ công anh bằng các dung môi n-hexan, diclometan, etyl axetat đƣợc thể hiện ở Bảng 3.7.
Bảng 3.7. Tổng hợp định danh các cấu tử có trong dịch chiết cây bồ công anh bằng các dung môi
TT Tên hợp chất Hàm lƣợng cấu tử (% diện tích peak) n- hexan DCM EtOAc 1 2(5H)- Furanone 0.86 2 2,5- Furandicarbonxaldehyde 2.18 3 Phenol, 2-methoxy- 2.74 4 4H- Pyran-4-one,2,3-dihydro- 3,5-dihydroxy-6-methyl- 8.38 5 Coumaran 4.76 6 5-Hydroxymethylfurfural 24.57 7 Ethanone, 1-(2-hydroxy- 5- methylphenyl)- 11.50 8 Phenol, 2,6- dimethoxy- 7.05 9 (3-Nitrophenyl) methanol, n- propyl ether 19.56 10 Octadecanoic acid 2.22
11 Isoshyobunone 2.61 12 Nookatone 5.53 13 Aristolene epoxide 1.18 14 Methyl Camphorsulfonates 2.50 15 Dehydroxy- isocalamendiol 4.36 16 E- 2- Tetradecen-1-ol 9.38 17 1-Allyl-1-but-3-enyl-1- silacyclobutane 52.03 29.47 18 Decane, 5,6- bis (2,2- dimethylpropylidence) 11.16 9.9
19 Adipic acid, 2,4- dimethylpent-3-
yl nonyl ester 27.43 20 Neophytadiene 5.9 21 1,1’- Bicyclohexyl, 4-propoxy- 4’-propyl- 4.04 22 Neophytadiene 2.97 23 4-t-Butyl- 2- (1-methyl-2- nitroethyl) cyclohexanone 14.13
24 Adipic acid, nonyl 2 – octyl ester 33.61
Tổng
Dựa vào Bảng 3.7 ta có thể tổng hợp kết quả x c định thành phần hóa học trong dịch chiết cây bồ công anh bằng các dung môi cụ thể nhƣ sau: Trong số các cấu tử x c định đƣợc trong các dịch chiết thì có 2 cấu tử trùng lặp trong 2 dung môi DCM và EtOAc là Decane, 5,6- bis (2,2- dimethylpropylidence) và 1-Allyl-1-but-3- enyl-1-silacyclobutane nhƣng kh c nhau về hàm lƣợng.
3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP CHẤT
Hợp chất BCAH1 đƣợc tách ra từ phân đoạn n-hexan của cây bồ công anh ở dạng rắn, màu trắng, tan tốt trong cloroform, axeton, metanol; Rf = 0,5 (Silica gel, D/M 10/1); không hiện màu với UV 245 nm, không hiện vệt với axit H2SO4 10% (115 oC, 3 phút).
3.3.1. Kết quả phân tích BCAH1
Bảng 3.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất BCAH1
BCAH1 C δC#, a δCa, b δHa, c (J, Hz) HMBC (HC) 1 65,4 65,2 4,22 (1H, dd, 4,5, 12,0), 4,15 (1H, dd, 6,5, 12,0) 1′, 2, 3 2 70,5 70,3 3,93 (1H, m) 1, 3 3 63,4 63,4 3,71 (1H, br d, 11,0), 3,60 (1H, dd, 11,0, 5,5) 1, 2 1′ 174,5 174,4 - 2′ 34,2 34,2 2,35 (2H, t, 7,5) 1′, 3′ 3′ 25,0 24,9 1,63 (2H, m) 1′, 2′ 4′- 13′ - 29,1-29,7 1,26* (20H, m) 14′ 32,1 31,9 1,26* (2H, m) 15′ 22,7 22,7 1,26* (2H, m) 16′ 14,0 14,1 0,88 (3H, t, 7,0) 14′, 15′
#δC của glycerol 1-palmitate [27], ađo tron CDCl3, b 125 MHz, c 500 MHz,
*Trên phổ 1H-NMR đã ghi nhận đƣợc các tín hiệu:
- Tín hiệu của 2 nhóm oxymethylene [4,22 (1H, dd, J = 4,5, 12,0 Hz, Ha-1) & 4,15 (1H, dd, J = 6,5, 12,0 Hz, Hb-1), 3,71 (1H, br d, J = 11,0 Hz, Ha-3) & 3,60 (1H, dd, J = 11,0, 5,5 Hz, Hb-3)].
- Tín hiệu của 1 nhóm oxymethine tại δH 3,93 (1H, m, H-2);
- Tín hiệu của 2 nhóm methylene ở H 2,35 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-2′) và 1,63 (2H, m, H-3′);
- Tín hiệu của 1 nhóm methyl bậc một ở H0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz, H-16′) và proton của nhiều nhóm methylene tại H1,26 (24H, m).
- Mặt khác, phổ 1H-NMR còn xuất hiện 2 tín hiệu của 2 proton thuộc nhóm – OH chƣa bị trao đổi tại δH 2,64 (1H, br s) và δH 2,21 (1H, br s) của hợp phần glycerol.
* Trên phổ 13C NMR và HSQC đã chỉ ra đƣợc tín hiệu:
- Tín hiệu của 1 cacbon carboxyl ở C 174,4 (C-1′).
- Tín hiệu tại δC 63,4, 65,2 và 70,3 thuộc về nhóm oxymethylene và oxymethine (C-1, 2, 3).
*C c tƣơng t c HMBC (Hình 3.7) cho thấy:
- Sự tƣơng t c giữa H-1 (δH 4,22 & 4,15) và C-1′ (δC 174,4)/C-2 (δC 70,3)/C- 3 (δC 63,4)
- Sự tƣơng t c giữa H-2′ (δH 2,35) và C-1′ (δC 174,4)/C-3′ (δC 24,9), - Sự tƣơng tác giữa H-16′ (δH 0,88) và C-14′ (δC 31,9)/C-15′ (δC 22,7)
Từ đó xác nhận một nhóm metyl tại C-16′ và chứng tỏ hợp chất BCAH1 là một monoglyceride, C-1 của hợp phần glycerol liên kết với một gốc axid no, mạch thẳng.
3.3.2. Kết quả quá trình metanol phân hợp chất BCAH1
Để x c định chính xác hợp phần axyl của monoglyceride, chúng tôi đã sử
dụng phƣơng ph p metanol phân hợp chất BCAH1. Dẫn xuất metyl este (FAME)
Hợp phần axyl đƣợc x c định là palmitoyl với thời gian lƣu của dẫn xuất
FAME là 21,2 phút trên sắc ký đồ GC-MS.
Hình 3.5. GC- MS của dẫn xuất FAME
3.3.3. Kết quả phân lập chất
Đối chiếu với tài liệu tham khảo [23], [27], [31], [32] hợp chất này đƣợc khẳng định là Glycerol 1-palmitate (Hình 3.10).
Hình 3.7. Tươn tác H BC ( ) chính của hợp chất BCAH1
Nhận xét:
Glycerol 1-palmitate (C19H3804) còn có tên gọi khác là 2,3-dihydroxypropyl hexadecanoate, 1-monopalmitoylglycerol, 1-Palmitoyl-rac-glycerol.... là chất có nhiều ứng dụng trong ngành dƣợc phẩm, mỹ phẩm...
- Glycerol 1-palmitate là một chất có khả năng có phản ứng trao đổi chất đối với chất gây độc cho gan và chất gây ung thƣ [43]. Điều này phù hợp với c c nghiên cứu trƣớc đây về khả năng giúp cải thiện, tăng cƣờng chức năng gan mật của cây bồ công anh, giúp chuyển hóa các chất béo trong gan, giải độc gan. Bên cạnh đó, việc tìm ra Glycerol 1-palmitate cho thấy cây bồ công anh chứa các thuộc tính có thể tiêu diệt các tế bào ung thƣ, điều này đã giải thích đƣợc nguyên nhân bồ công anh có ảnh hƣởng lớn trên các tế bào ác tính và có khả năng kh ng hóa trị liệu mà không làm tổn hại đến các tế bào khỏe mạnh, cũng nhƣ khả năng phòng ngừa ung thƣ của cây bồ công anh.
- Glycerol-1-palmitate còn đƣợc tìm thấy trong chất béo và dầu. Glycerol-1-
palmitate là một thành phần nhỏ của dầu ô liu và dầu thực vật khác [43].
- Glycerol-1-palmitate có thể đƣợc sử dụng nhƣ một chất để x c định và phân biệt các enzym thủy phân [43].
- Glycerol-1-palmitate có thể đƣợc sử dụng ở nồng độ lên đến 12% trong c c sản phẩm mỹ phẩm [43].
3.4. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC
C c nghiên cứu hoạt tính sinh học dựa trên thành phần hóa học cho thấy c c dịch chiết có hoạt tính chống oxi hóa rất cao. Trong dịch chiết metanol của cây bồ công anh, khối lƣợng cao chiết theo tính toán trong dịch chiết metanol cũng lớn nhất (cao tổng) so với các dung môi còn lại. Chính vì vậy, t c giả lấy cao
chiết metanol của cây bồ công anh để thử hoạt tính chống oxi hóa, kiểm định tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả đƣợc nêu trong Bảng 3.9 và Bảng 3.10. Dịch chiết metanol của cây bồ công anh đƣợc thử nghiệm hoạt tính - sàng lọc hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO) trên tế bào RAW264.7 và hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ gan