3. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.2 Phương pháp nghiên cứu trong phịng thí nghiệm
3.3.2.1 Phương pháp nấu môi trường
* Môi trường PGA (Potato- Glucose- Agar)
Thành phần: + Khoai tây 200 g + Glucose 20 g + Agar 20 g + Nước cất 1000 ml
Cách điều chế: Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, thái lát mỏng cho vào nồi cùng với 1000 ml nước cất đun sôi khoảng 1 giờ. Lọc qua vải lọc, bổ sung
nước cất cho đủ 1000 ml. Cho agar và glucose vào khuấy đều cho agar tan hết, đun cho đến khi sôi. Cho mơi trường này vào bình tam giác đậy nắp bằng giấy bạc, sau đó đem hấp khử trùng ở 1210C (1,5 atm) trong vòng 45 phút. Để nguội 55 - 600C trước khi rót ra đĩa petri đã khử trùng [26].
* Môi trường WA (Water Agar) Thành phần: +Agar 20 g
+ Nước cất 1000 ml Cách điều chế: tương tự như môi trường PGA
3.3.2.2 Phương pháp phân lập nấm
Chọn những mẫu bệnh cịn tươi mới, có triệu chứng điển hình đem về phịng thí nghiệm rửa sạch dưới vịi nước sau đó dùng giấy thấm khô rồi khử trùng bề mặt bằng cồn 960. Cắt mô bệnh thành từng miếng nhỏ 1 – 2 mm (chứa cả phần mô bệnh và phần mô khoẻ) để cấy lên môi trường. Sau 3 – 4 ngày, chọn tản nấm phát triển tốt, cấy truyền sang môi trường PGA (cấy truyền khoảng 4 – 5 lần cho đến khi thu được nấm thuần (Isolate).
Kiểm tra vi sinh vật gây bệnh bằng kính hiển vi, xác định đặc điểm hình thái, mầu sắc, kích thước của tản nấm, cành bào tử, bào tử phân sinh và các cơ quan sinh sản của nấm [26].
3.3.2.3 Phương pháp thu thập mẫu hạt giống lạc
Lấy mẫu hạt giống tại huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An: Chọn 3 xã có diện tích trồng lạc lớn, có địa thế đất, cơng thức luân canh, mật độ gieo trồng và điều kiện sinh thái đại diện cho vùng, mỗi xã thu thập 09 mẫu từ 09 nông hộ. Mẫu thu được trộn theo xã, trộn tiếp theo huyện thành mẫu tổng hợp, lấy mẫu phân tích từ mẫu tổng hợp, lượng mẫu phân tích là 500 gam củ hoặc 300g hạt giống.
3.3.2.4 Phương pháp giám định bệnh hại trên hạt giống lạc
* Chúng tôi tiến hành thu thập các mẫu hạt giống của vụ xuân 2008 và tiến hành thí nghiệm vào vụ xuân 2009.
* Giám định nấm gây hại hạt giống theo tài liệu giám định bệnh hại hạt giống của Viện nghiên cứu bệnh hạt giống Đan Mạch (Mathur S.B và Olga K., 2001), kiểm tra nấm bệnh tồn tại trên hạt giống bằng phương pháp giấy thấm.
* Phương pháp chia mẫu: mẫu hạt giống được trải đều trên mặt phẳng
theo hình trịn. Chia mặt phẳng làm 4 phần đều nhau. Lấy mỗi phần một lượng nhất định sau đó trộn đều sao cho đủ lượng mẫu kiểm tra. Lượng mẫu kiểm tra: 200 hạt.
* Phương pháp giám định bệnh hại trên hạt giống bằng phương pháp giấy thấm: Đặt 10 hạt trên giấy thấm đã được làm ẩm bằng nước cất vô trùng trong đĩa petri đã được khử trùng. Sau đó đặt chúng trong phịng ủ đảm bảo 12 giờ sáng, 12 giờ tối ở nhiệt độ 22 - 250C. Sau 7 ngày kiểm tra mẫu, soi hạt dưới kính lúp điện lần lượt từ vịng ngồi vào trong theo tâm đĩa, đối với những nấm chưa xác định rõ thì phải khều được bào tử nấm để soi dưới kính hiển vi, hoặc cho lên mơi trường WA để làm thuần nấm, sau đó chuyển sang môi trường PGA để quan sát tản nấm.
* Các chỉ tiêu theo dõi: TL bệnh, TL nảy mầm, TL hạt cứng, TL hạt thối.
3.3.2.5 Thử nghiệm một số dịch chiết thực vật trong việc ức chế nấm bệnh hại hạt giống lạc
* Dịch chiết tỏi
Phương pháp thu dịch chiết tỏi: tỏi bóc vỏ, đem nghiền nhỏ, vắt lấy dịch, sau đó pha lỗng ra thành các nồng độ 5%, 10%, 15% và dùng ngay sau khi pha.
Ngâm hạt trong mỗi nồng độ dịch chiết ở các khoảng thời gian 5 phút, 10 phút và 15 phút, sau đó chắt dịch chiết, thấm khơ hạt bằng giấy thấm đã được hấp vô trùng. Đặt hạt trên giấy thấm được phun ẩm bằng nước cất vô trùng để trong hộp petri, mỗi hộp petri đặt 10 hạt, sau 7 ngày kiểm tra theo phương pháp giám định bệnh hại hạt giống trên hạt.
công thức, mỗi công thức là 30 hạt, nhắc lại 4 lần, thử nghiệm trên giống L14.
+ Thí nghiệm với dịch chiết tỏi 5%
CT1: Đối chứng (ngâm hạt trong nước cất).
CT2: Ngâm hạt với dịch chiết tỏi ở nồng độ 5% trong 5 phút. CT3: Ngâm hạt với dịch chiết tỏi ở nồng độ 5% trong 10 phút. CT4: Ngâm hạt với dịch chiết tỏi ở nồng độ 5% trong 15 phút.
+ Thí nghiệm với dịch chiết tỏi 10%
CT1: Đối chứng (ngâm hạt trong nước cất).
CT2: Ngâm hạt với dịch chiết tỏi ở nồng độ 10% trong 5 phút. CT3: Ngâm hạt với dịch chiết tỏi ở nồng độ 10% trong 10 phút. CT4: Ngâm hạt với dịch chiết tỏi ở nồng độ 10% trong 15 phút.
+ Thí nghiệm với dịch chiết tỏi 15%
CT1: Đối chứng (ngâm hạt trong nước cất).
CT2: Ngâm hạt với dịch chiết tỏi ở nồng độ 15% trong 5 phút. CT3: Ngâm hạt với dịch chiết tỏi ở nồng độ 15% trong 10 phút. CT4: Ngâm hạt với dịch chiết tỏi ở nồng độ 15% trong 15 phút. * Dịch chiết sả và dịch chiết gừng:
Phương pháp thu dịch chiết sả: Củ sả rửa sạch, cho vào máy nghiền nhỏ, vắt lấy dịch, sau đó pha lỗng thành các nồng độ 5%, 10%, 15% và dùng ngay sau khi pha.
Phương pháp thu dịch chiết gừng: Tương tự, củ gừng rửa sạch, cho vào máy nghiền nhỏ, vắt lấy dịch, sau đó pha lỗng thành các nồng độ 5%, 10%, 15% và dùng ngay sau khi pha.
Tiến hành thí nghiệm và bố trí các cơng thức tương tự như đối với dịch chiết tỏi.
Chỉ tiêu theo dõi: TL nảy mầm, TL mầm bình thường, TL mầm dị dạng và TL mầm và hạt nhiễm nấm.