Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.2. Phương pháp phân lập mẫu nấm bệnh
Thu mẫu:
Quy trình thu mẫu được thực hiện tại các tỉnh Thái Bình, Hà Nội, Phú Thọ và Yên Bái. Qua 2 ngày thu mẫu thì thu được 18 mẫu trong đó có 8 mẫu đất, 2 mẫu lá, 2 mẫu thân, 2 mẫu quả, 4 mẫu rễ từ cây chanh và bưởi.
Lựa chọn cây có khả năng đang ủ bệnh, các cây có dấu hiệu như thối rễ, tàn lụi lá, thân xì mủ, thối quả, ngồi ra khi đào thử đất xung quanh lên thấy có mùi hơi thối.
Mẫu đất, rễ được lấy theo hình chiếu tán cây xuống, tán cây đến đâu thì lấy mẫu đến đó. Sau khi lựa chọn được vị trí thích hợp, dùng cuốc gạt đi lớp đất bề mặt cũng như tàn dư thực vật phía trên (khoảng 10cm), đất và rễ được lấy ở tầng đất 10-30cm, lấy mẫu đất không lấy quá khô hay quá ướt. Mỗi mẫu đất lấy ở 2 địa điểm khác nhau trên cùng 1 cây và trộn với nhau, khoảng 200g đất và 100g rễ/mẫu. Ghi rõ thông tin mẫu.
Phân lập nấm Phytophthora Bẫy nấm bằng cánh hoa hồng.
Sau khi thu mẫu từ nơi bị bệnh, cân 100g đất cho vào cốc nhựa sau đó đổ nước vào sao cho khoảng cách giữa đất và nước là 7cm, khuấy nhẹ đất trong cốc, vớt bọt và các vật khác nổi lên trên bề mặt, để yên một lúc. Sau đó lấy từng cánh hoa hồng cho vào trên bề mặt cốc sao cho cánh hoa hồng chỉ tiếp xúc với bề mặt chứ khơng chìm trong dung dịch.
Làm tương tự với các mẫu còn lại (rễ, thân và lá). Để cốc ở nơi thoáng mát và quan sát 3 ngày.
Nếu cánh hoa hồng chuyển từ màu đỏ sang màu nâu cánh gián thì đó là nấm
Phytophthora, còn lại cánh hoa hồng khơng đổi màu thì đó khơng phải là nấm Phytophthora.
Phân lập nấm Phytopthora.
Phân lập từ mẫu trực tiếp. Đối với mẫu đất:
1.Trước hết các mẫu đất phải được xử lý trước khi phân lập bằng cách phơi khơ ở nhiệt độ phịng 2-3 ngày, sau đó dùng rây qua sàng có kích thước 2- 3mm.
2. Cân 1g đất đã xử lý cho vào 9ml nước cất khử trùng, sử dụng máy vortex để trộn đều mẫu.
3. Pha loãng mẫu ở các nồng độ pha loãng khác nhau: 10-4, 10-5 để phân lập nấm trong đất.
4. Hút 0,5 ml dịch pha loãng ở 2 nồng độ trên nhỏ lên đĩa Petri chứa môi trường phân lập (môi trường PDA). Dùng que gạt trang đều dịch trên bề mặt thạch. Quan sát đĩa sau 3-4 ngày.
Mẫu rễ, thân, lá sau khi mang về thì rửa sạch sau đó khử trùng bằng nước Javen 5% trong vịng 10 phút sau đó để ráo và đặt trên đĩa thạch chứa môi trường PDA.
Đặt đĩa thạch trong tủ 30°C. Quan sát đĩa sau 3-4 ngày.
Phân lập từ cách hoa hồng. Môi trường dùng để phân lập là PDA.
Chọn lựa những cánh hoa hồng đã chuyển từ màu đỏ sang màu nâu cánh, sau đó cắt nhỏ cánh hoa những chỗ đã xỉn màu sau đó đặt lên trên đĩa petri có chứa mơi trường PDA.
Đặt đĩa thạch trong tủ 30°C. Quan sát đĩa sau 3-4 ngày.