Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.7. Khảo sát một số đặc điểm hình thái và sinh học của chủng vi sinh vật
3.5.7.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn và vi khuẩn
a. Đặc điểm hình thái
► Đặc điểm hình thái khuẩn lạc:
Cấy các chủng xạ khuẩn thành từng khuẩn lạc đơn trên môi trường thạch Gause-1. Sau khi nuôi từ 4 – 5 ngày ở 30ºC lấy ra quan sát hình thái khuẩn lạc, mép khuẩn lạc. Các dạng khuẩn lạc có thể là dạng thơ ráp, dạng phấn, khơng trong suốt, có nếp tỏa ra theo hình phóng xạ dạng bơng, dạng nhẵn, dạng nhăn nheo…
Cấy các chủng vi khuẩn trên môi trường LB. Sau nuôi cấy 1-2 ngày ở 30oC lấy ra quan sát màu sắc, kích thước, độ nhầy....
► Cuống sinh bào tử, bào tử:
Chủng xạ khuẩn được cấy trên môi trường ISP2, găm lamen xuống đường cấy nghiêng một góc 45°, vi khuẩn được cấy trên mơi trường LB. Nuôi trong tủ nuôi 30°C và quan sát chuỗi bào tử, cuống sinh bào tử, bề mặt bào tử sau từng ngày ni cấy dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần.
Nhuộm gram đối với vi khuẩn
Được thực hiện theo mô tả của Nguyễn Lân Dũng và Đinh Thúy Hằng (2006)
Nhỏ một giọt nước lên lam kính, dùng tam lấy một ít tế bào vi khuẩn vào giọt nước trên lam kính, dàn dều, cho đến khi khơ, hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn.
Nhuộm bằng dung dịch gentian trong 1 phút, sau đó rửa bằng nước. Tẩy màu bằng cồn trong 3-5 giây, sau đó rửa lại bằng nước.
Nhuộm bằng dung dịch fucshin trong 1 phút sau đó rửa lại bằng nước. Để mẫu khơ tự nhiên và soi ở vật kính x100.
b. Một số đặc điểm sinh lý – sinh hóa
► Khả năng chịu muối:
Khả năng chịu muối của chủng xạ khuẩn ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển, phản ánh đến khả năng chịu mặn của chúng trong môi trường tự nhiên. Theo Larsen (1986) vi sinh vật chịu ưa muối có thể nhóm thành các nhóm theo
nhu cầu về muối của chúng, các sinh vật chịu nồng độ muối thấp có thể sinh trưởng trong môi trường nước biển với nồng độ muối từ 2-3%. Các sinh vật thuộc nhóm chịu muối trung bình có thể sinh trưởng tại nồng độ NaCl từ 5-20% (w/v). Nhóm sinh vật chịu nồng độ muối cao có thể sinh trưởng tại nồng độ muối bão hịa, khơng sinh trưởng khi nồng độ NaCl thấp hơn 12%. Các chủng xạ khuẩn thuộc nghiên cứu này chịu nồng độ muối tới 7% nên có thể xếp vào nhóm chịu muối trung bình.
Chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause I trên ống thạch nghiêng được bổ sung NaCl với nồng độ từ 0%, 0,05%, 0,5%, 1%, 3%, 5%, 7%. Sau đó đem ủ ở nhiệt độ 370C. Quan sát khả năng sinh trưởng và phát triển của xạ khuẩn ở các nồng độ muối này.
► Khả năng di động của vi khuẩn:
Tiến hành: Dùng que cấy thẳng lấy sinh khối vi khuẩn, cấy đâm sâu gần hết
chiều dài khối thạch trong ống nghiệm. Ủ ở 300C trong 2 ngày.
Vi khuẩn có khả năng di động sẽ mọc lan khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh. Vi khuẩn khơng có khả năng di động chỉ mọc quanh đường cấy
► Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của xạ khuẩn, vi khuẩn:
Chủng xạ khuẩn được nuôi trên MT Gause-I ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Quan sát sự sinh trưởng sau 5 - 7 ngày.
Vi khuẩn được nuôi cấy trên đĩa petri chứa môi trường LB ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Quan sát sự sinh trưởng sau 2 ngày.
► Khả năng sinh enzyme ngoại bào Hoạt tính cellulase (phân hủy cellulose) Sử dụng phương pháp khuếch tán đĩa thạch:
Ni lỏng xạ khuẩn lỏng lắc 200 vịng/phút ở 37oC trong vịng 4-5 ngày. Sau đó ly tâm dịch ni cấy 8000 vịng/phút trong 10 phút, ta thu được dịch enzyme thô.
Dùng đầu côn (d = 7mm) đục các lỗ thạch trên mơi trường thử hoạt tính enzyme từng loại.
Nhỏ 100µl dịch enzyme thơ vào các lỗ thạch đã được chuẩn bị trên mơi trường. Sau đó để tủ lạnh 4oC khoảng 4-6 giờ, rồi chuyển sang tủ nuôi 37oC ủ từ 1-2 ngày.
Nhỏ thuốc thử lugol (đối với hoạt tính cellulase) lên bề mặt thạch, và đo đường kính vịng phân giải (D)
Hoạt tính enzyme được xác định theo công thức: D-d (mm). Với d là đường kính lỗ thạch, D là đường kính vịng phân giải.