3.4.1. Dụng cụ
Ống nghiệm, đĩa Petri, micropipet (50μl-1000μl), ống đong, cốc thuỷ tinh, đũa thuỷ tinh, pipet thuỷ tinh (1ml, 5ml, 10ml), que chang, que cấy, bao hấp, giấy gói, chun, ống Eppendorf, ống fancol, bình xịt, ...
3.4.2. Thiết bị
Tủ cấy vô trùng (Nuaire, Mỹ), tủ nuôi vi sinh vật (Sanyo, Nhật Bản), nồi hấp (Harayma, Nhật Bản), tủ sấy (Đức), máy ly tâm to (SORVALL RC 6, Đức), máy đo pH (Horia, Nhật Bản), lò vi sóng (Sanyo, Nhật Bản), bếp điện, nhiệt kế, cân điện tử, tủ lạnh (Sanyo, Nhật bản), và một số thiết bị khác.
3.4.3. Hoá chất
HCl 5%,NaOH 5% Cồn 70%, cồn 90%
Các hóa chất pha môi trường
Hóa chất nghiên cứu một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi sinh vật Hóa chất để tách chiết DNA, PCR, điện di.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Giữ giống vi sinh vật 3.5.1. Giữ giống vi sinh vật
Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng: Các chủng vi khuẩn sau đi
được làm thuần thì sẽ được cấy trên môi trường thạch nghiêm trong ống nghiệm để giữ giống (Lương Đức Phẩm, 2004). Các chủng được cấy trên bề mặt thạch nghiêng và nuôi ở 300Ctrong 2 ngày. Ống giống được bảo quản ở 40C, cấy chuyển hàng tháng và được hoạt hóa trước khi nhân giống.
3.5.2. Phương pháp phân lập mẫu nấm bệnh
Thu mẫu:
Quy trình thu mẫu được thực hiện tại các tỉnh Thái Bình, Hà Nội, Phú Thọ và Yên Bái. Qua 2 ngày thu mẫu thì thu được 18 mẫu trong đó có 8 mẫu đất, 2 mẫu lá, 2 mẫu thân, 2 mẫu quả, 4 mẫu rễ từ cây chanh và bưởi.
Lựa chọn cây có khả năng đang ủ bệnh, các cây có dấu hiệu như thối rễ, tàn lụi lá, thân xì mủ, thối quả, ngoài ra khi đào thử đất xung quanh lên thấy có mùi hơi thối.
Mẫu đất, rễ được lấy theo hình chiếu tán cây xuống, tán cây đến đâu thì lấy mẫu đến đó. Sau khi lựa chọn được vị trí thích hợp, dùng cuốc gạt đi lớp đất bề mặt cũng như tàn dư thực vật phía trên (khoảng 10cm), đất và rễ được lấy ở tầng đất 10-30cm, lấy mẫu đất không lấy quá khô hay quá ướt. Mỗi mẫu đất lấy ở 2 địa điểm khác nhau trên cùng 1 cây và trộn với nhau, khoảng 200g đất và 100g rễ/mẫu. Ghi rõ thông tin mẫu.
Phân lập nấm Phytophthora
Bẫy nấm bằng cánh hoa hồng.
Sau khi thu mẫu từ nơi bị bệnh, cân 100g đất cho vào cốc nhựa sau đó đổ nước vào sao cho khoảng cách giữa đất và nước là 7cm, khuấy nhẹ đất trong cốc, vớt bọt và các vật khác nổi lên trên bề mặt, để yên một lúc. Sau đó lấy từng cánh hoa hồng cho vào trên bề mặt cốc sao cho cánh hoa hồng chỉ tiếp xúc với bề mặt chứ không chìm trong dung dịch.
Làm tương tự với các mẫu còn lại (rễ, thân và lá). Để cốc ở nơi thoáng mát và quan sát 3 ngày.
Nếu cánh hoa hồng chuyển từ màu đỏ sang màu nâu cánh gián thì đó là nấm
Phytophthora, còn lại cánh hoa hồng không đổi màu thì đó không phải là nấm
Phytophthora.
Phân lập nấm Phytopthora.
Phân lập từ mẫu trực tiếp. Đối với mẫu đất:
1.Trước hết các mẫu đất phải được xử lý trước khi phân lập bằng cách phơi khô ở nhiệt độ phòng 2-3 ngày, sau đó dùng rây qua sàng có kích thước 2- 3mm.
2. Cân 1g đất đã xử lý cho vào 9ml nước cất khử trùng, sử dụng máy vortex để trộn đều mẫu.
3. Pha loãng mẫu ở các nồng độ pha loãng khác nhau: 10-4, 10-5 để phân lập nấm trong đất.
4. Hút 0,5 ml dịch pha loãng ở 2 nồng độ trên nhỏ lên đĩa Petri chứa môi trường phân lập (môi trường PDA). Dùng que gạt trang đều dịch trên bề mặt thạch. Quan sát đĩa sau 3-4 ngày.
Mẫu rễ, thân, lá sau khi mang về thì rửa sạch sau đó khử trùng bằng nước Javen 5% trong vòng 10 phút sau đó để ráo và đặt trên đĩa thạch chứa môi trường PDA.
Đặt đĩa thạch trong tủ 30°C. Quan sát đĩa sau 3-4 ngày.
Phân lập từ cách hoa hồng. Môi trường dùng để phân lập là PDA.
Chọn lựa những cánh hoa hồng đã chuyển từ màu đỏ sang màu nâu cánh, sau đó cắt nhỏ cánh hoa những chỗ đã xỉn màu sau đó đặt lên trên đĩa petri có chứa môi trường PDA.
Đặt đĩa thạch trong tủ 30°C. Quan sát đĩa sau 3-4 ngày.
3.5.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của chủng nấm
Quan sát hình thái của nấm sau khi nuôi cấy chúng ở nhiệt độ 30°C sau 24h nuôi cấy. Quan sát đặc điểm sinh học của nấm.
Các đặc điểm hình thái đặc trưng cần quan sát: Hình dạng bào tử, đặc điểm cuống sinh bào tử, bào tử.
Bước 1: Làm tiêu bản trên lam kính, lam kính cần rửa sạch, lamen bọc giấy hấp khử trùng ở 121°C trong 45 phút.
Bước 2: Làm trong điều kiện tủ cấy vô trùng, dùng que cấy lấy sợi nấm đặt trên lam kính sau đó từ từ đậy lamen lên một cách nhẹ nhàng nghiêng từ 45° xuống.
Bước 3: Để thấy rõ đặc điểm hình thái cần sử dụng thuốc nhuộm. Cách sử dụng thuốc nhuộm:
Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc với vi sinh vật và được pha loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm màu.
Cách nhuộm :
Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh metylen 0,001% lên phiến kính. Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm.
Đậy lá kính lên giọt dịch. Có thể nhỏ thêm dầu kính để soi rõ hơn. Quan sát tiêu bản ở vật kính khác nhau.
3.5.4. Phương pháp tái lây nhiễm
Sau khi phân lập thu được chủng nấm thuần nuôi ở 30°C trên môi trường PDA rồi tiến hành tái lây nhiễm.
Các bước thực hiện quá trình tái lây nhiễm:
Bước 1: Pha môi trường PDA lỏng (môi trường không bổ sung thêm agar), sau khi pha được môi trường chuẩn bị ống nghiệm đã được hấp khử trùng ở 121°C trong 45 phút.
Bước 2: Hút mỗi ống nghiệm 5-7ml sau đó bịt chặt đầu ống nghiệm lại bằng nút bông, sau khi xong mang ống nghiệm đi hấp khử trùng ở 121°C trong 45 phút
Bước 3: Làm trong điều kiện tủ cấy vô trùng, dùng dao cắt nhỏ từng chủng nấm, dùng que cấy cho vào từng ống nghiệm, nút bông chặt lại. Ghi rõ tên chủng, thời gian ở thành ống nghiệm.
Bước 4: Nuôi lắc ở 30°C trong 7 ngày.
Bước 5: Lây nhiễm nhân tạo trên quả chanh qua vết thương trên quả. Tạo một vết cắt (dài 3-4 mm) trên vỏ mỗi quả bằng một dao mổ. Tưới dịch nấm đã được chuẩn bị và đắp trực tiếp sợi nấm lên vết cắt. Trên quả chanh làm đối chứng, thực hiện tương tự, thay dịch nấm bằng nước cất và không đắp sợi nấm lên vết cắt. Quan sát quả chanh sau 1 tuần, nếu quả chanh đổi từ màu vàng sang màu nâu là dấu hiệu của quả bị nhiễm nấm và ngược lại.
Qúa trình lây nhiễm nhân tạo là một trong những bước đặc biệt quan trọng để xác định được các chủng nấm gây bệnh cho cây. Phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.5.5. Đánh giá dặc điểm sinh học
a. Khả năng sinh enzyme cellulase
Cách thu dịch:
Nấm được nuôi cấy trong môi trường PDA lỏng, lắc 200 vòng/phút sau 36-48h tiến hành thu dịch lỏng. Dịch lỏng mang đi ly tâm, dùng pipet hút dịch lỏng nhỏ vào lỗ trên đĩa thạch sao cho dịch không tràn ra ngoài.
Phương pháp thử khả năng sinh enzyme ngoại bào của nấm (enzyme cellulase)
Phương pháp đục lỗ trên thạch: môi trường gồm agar (18g/l) + nước cất + 1% cơ chất tương ứng với từng loại enzyme được hấp khử trùng, đổ vào đĩa petri.
Chờ môi trường nguội, dùng khuyên đục lỗ (đường kính 1cm). Nhỏ dịch nghiên cứu vào lỗ thạch. Để trong tử lạnh 4°C trong vòng 4h. Ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30°C thời gian 18h-24h. Nhuộm màu bằng thuốc nhuộm tương ứng; sau đó đo đường kính vòng phân giải (D). Từ đó ta có kích thước vòng phân giải (D- d).
Sử dụng thuốc nhuộm lugol đổ đầy lên đĩa thạch rồi đổ lugol đi sau đó xác định hoạt tính của enzyme bằng cách đo vòng thủy phân.
b. Ảnh hưởng của chất dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng
Sử dụng môi trường PDA, WA, V8-juice agar sau đó sử dụng 1 chủng nấm cấy trên 3 môi trường. Quan sát sự phát triển của chúng sau 2 ngày, ghi rõ đặc điểm hình thái nấm so sánh sự phát triển của chúng qua các ngày.
3.5.6. Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh của các chủng vi sinh vật chủng vi sinh vật
Phương pháp đồng nuôi cấy (Dhanasekaran et al., 2012): Khả năng
đối kháng của các chủng xạ khuẩn với các chủng nấm gây bệnh trong điều kiện in vitro được đánh giá bằng phương pháp đồng nuôi cấy trên môi trường PGA. Nấm bệnh được cấy ở trung tâm đĩa petri, chủng xạ khuẩn được cấy ở 4 góc bao quanh nấm bệnh cách tâm đĩa 3cm. Đường kính vòng ức chế sinh trưởng được xác định sau 4-7 ngày nuôi cấy ở 30oC.
Phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Dhanasekaran et al., 2012): Xạ khuẩn được nuôi trong môi trường Gause I lỏng (g/l): Tinh bột tan 20g; K2HPO4
0,5g; MgSO4.7H2O 0,5g; NaCl 0,5g; KNO3 0,5g; FeSO4 0,01g; pH 7,4), lắc 200 vòng/ phút ở 30oC. Dịch xạ khuẩn được thu sau 7 ngày nuôi cấy. Nấm được hoạt hóa và làm thuần trên môi trường PDA, dùng que cấy lấy sợi nấm cho vào ống eppendorf chứa 500µl nước cất vô trùng, voltex để bào tử nấm phát tán đều trong nước. Giếng thạch được tạo trên đĩa thạch PDA đã được cấy trải 50µl dung dịch nấm. 100µl dịch xạ khuẩn được ly tâm với tốc độ 8.000 vòng/ phút trong 30 phút, 4oC và dịch xạ khuẩn không ly tâm được bổ sung vào giếng thạch, ủ ở 30oC. Dịch xạ khuẩn có khả năng ức chế sinh trưởng của nấm được thể hiện thông qua vòng sáng xuất hiện quanh giếng thạch.
Phương pháp thỏi thạch (Nguyễn Lân Dũng và Phạm Thị Trân Châu, 1978): Xạ khuẩn được cấy đều trên đĩa petri chứa môi trường Gause I ở 30oC. Sau 7 ngày nuôi cấy, thỏi thạch xạ khuẩn được cấy vào đĩa petri chứa môi trường
PDA đã được cấy trải nấm, ủ ở 4oC trong 4 - 5 giờ để các hoạt chất từ thỏi thạch khuếch tán vào môi trường, sau đó cho vào tủ nuôi, quan sát kết quả sau 4 ngày.
3.5.7. Khảo sát một số đặc điểm hình thái và sinh học của chủng vi sinh vật
3.5.7.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn và vi khuẩn
a. Đặc điểm hình thái
► Đặc điểm hình thái khuẩn lạc:
Cấy các chủng xạ khuẩn thành từng khuẩn lạc đơn trên môi trường thạch Gause-1. Sau khi nuôi từ 4 – 5 ngày ở 30ºC lấy ra quan sát hình thái khuẩn lạc, mép khuẩn lạc. Các dạng khuẩn lạc có thể là dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có nếp tỏa ra theo hình phóng xạ dạng bông, dạng nhẵn, dạng nhăn nheo…
Cấy các chủng vi khuẩn trên môi trường LB. Sau nuôi cấy 1-2 ngày ở 30oC lấy ra quan sát màu sắc, kích thước, độ nhầy....
► Cuống sinh bào tử, bào tử:
Chủng xạ khuẩn được cấy trên môi trường ISP2, găm lamen xuống đường cấy nghiêng một góc 45°, vi khuẩn được cấy trên môi trường LB. Nuôi trong tủ nuôi 30°C và quan sát chuỗi bào tử, cuống sinh bào tử, bề mặt bào tử sau từng ngày nuôi cấy dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần.
Nhuộm gram đối với vi khuẩn
Được thực hiện theo mô tả của Nguyễn Lân Dũng và Đinh Thúy Hằng (2006)
Nhỏ một giọt nước lên lam kính, dùng tam lấy một ít tế bào vi khuẩn vào giọt nước trên lam kính, dàn dều, cho đến khi khô, hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn.
Nhuộm bằng dung dịch gentian trong 1 phút, sau đó rửa bằng nước. Tẩy màu bằng cồn trong 3-5 giây, sau đó rửa lại bằng nước.
Nhuộm bằng dung dịch fucshin trong 1 phút sau đó rửa lại bằng nước. Để mẫu khô tự nhiên và soi ở vật kính x100.
b. Một số đặc điểm sinh lý – sinh hóa
► Khả năng chịu muối:
Khả năng chịu muối của chủng xạ khuẩn ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển, phản ánh đến khả năng chịu mặn của chúng trong môi trường tự nhiên. Theo Larsen (1986) vi sinh vật chịu ưa muối có thể nhóm thành các nhóm theo
nhu cầu về muối của chúng, các sinh vật chịu nồng độ muối thấp có thể sinh trưởng trong môi trường nước biển với nồng độ muối từ 2-3%. Các sinh vật thuộc nhóm chịu muối trung bình có thể sinh trưởng tại nồng độ NaCl từ 5-20% (w/v). Nhóm sinh vật chịu nồng độ muối cao có thể sinh trưởng tại nồng độ muối bão hòa, không sinh trưởng khi nồng độ NaCl thấp hơn 12%. Các chủng xạ khuẩn thuộc nghiên cứu này chịu nồng độ muối tới 7% nên có thể xếp vào nhóm chịu muối trung bình.
Chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause I trên ống thạch nghiêng được bổ sung NaCl với nồng độ từ 0%, 0,05%, 0,5%, 1%, 3%, 5%, 7%. Sau đó đem ủ ở nhiệt độ 370C. Quan sát khả năng sinh trưởng và phát triển của xạ khuẩn ở các nồng độ muối này.
► Khả năng di động của vi khuẩn:
Tiến hành: Dùng que cấy thẳng lấy sinh khối vi khuẩn, cấy đâm sâu gần hết
chiều dài khối thạch trong ống nghiệm. Ủ ở 300C trong 2 ngày.
Vi khuẩn có khả năng di động sẽ mọc lan khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh. Vi khuẩn không có khả năng di động chỉ mọc quanh đường cấy
► Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của xạ khuẩn, vi khuẩn:
Chủng xạ khuẩn được nuôi trên MT Gause-I ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Quan sát sự sinh trưởng sau 5 - 7 ngày.
Vi khuẩn được nuôi cấy trên đĩa petri chứa môi trường LB ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Quan sát sự sinh trưởng sau 2 ngày.
► Khả năng sinh enzyme ngoại bào Hoạt tính cellulase (phân hủy cellulose) Sử dụng phương pháp khuếch tán đĩa thạch:
Nuôi lỏng xạ khuẩn lỏng lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong vòng 4-5 ngày. Sau đó ly tâm dịch nuôi cấy 8000 vòng/phút trong 10 phút, ta thu được dịch enzyme thô.
Dùng đầu côn (d = 7mm) đục các lỗ thạch trên môi trường thử hoạt tính enzyme từng loại.
Nhỏ 100µl dịch enzyme thô vào các lỗ thạch đã được chuẩn bị trên môi trường. Sau đó để tủ lạnh 4oC khoảng 4-6 giờ, rồi chuyển sang tủ nuôi 37oC ủ từ 1-2 ngày.
Nhỏ thuốc thử lugol (đối với hoạt tính cellulase) lên bề mặt thạch, và đo đường kính vòng phân giải (D)
Hoạt tính enzyme được xác định theo công thức: D-d (mm). Với d là đường kính lỗ thạch, D là đường kính vòng phân giải.
3.5.8. Định danh chủng nấm bệnh, xạ khuẩn, vi khuẩn Tách chiết DNA chủng nấm bệnh Tách chiết DNA chủng nấm bệnh
Cho 150 µl đệm chiết vào ống eppendorf đã chuẩn bị sẵn
Dùng tăm nhọn lấy mẫu nấm bệnh cho vào ống eppendorf bên trên (lượng lấy cỡ đầu một que diêm).
Dùng chày nhựa nghiền nát sinh khối sợi nấm trong ống eppendorf Bổ sung thêm 450µl đệm chiết vào ống eppendorf bên trên
Hỗn hợp được trộn đều, đem ủ ở 60°C trong 30 phút đến 1 giờ
Sau đó bổ sung thêm 200µl natri acetate 5M, trộn đều và ly tâm ở 12000vòng/phút, trong 30 phút, ở 4°C.
Dịch nổi được chuyển sang một ống Eppendorf mới và bổ sung isopropanol lạnh để tủa DNA. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Sau đó đem ly tâm ở 12000vòng/phút, 15 phút, 4°C
Đổ bỏ phần dịch trong nhẹ nhàng, tủa được rửa trong 1000µl ethanol 70% Ly tâm ở 10000v/phút, 10 phút, 4°C, sau đó để khô và bổ sung thêm 50µl TE
Sản phẩm được điện di trên gel agarose 1% được chuẩn bị bằng đêm TAE và chứa 0,5 mg/mL ethidium bromide
Phản ứng PCR nhân trình tự
Khuếch đại vùng bảo thủ của ITS rRNA với cặp mồi có Trình tự cặp mồi: ITS1 : 5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ITS4 : 5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ Thành phần phản ứng: Nước : 6µl Master mix (2X) : 10µl ITS1 : 1µl ITS4 : 1µl
AND : 2µl Tổng thể tích : 20µl
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:
Biến tính: 95°C - 5 phút.