Định danh chủng nấm bệnh, xạ khuẩn, vi khuẩn

Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.5. Phương pháp nghiên cứu

3.5.8. Định danh chủng nấm bệnh, xạ khuẩn, vi khuẩn

Tách chiết DNA chủng nấm bệnh

 Cho 150 µl đệm chiết vào ống eppendorf đã chuẩn bị sẵn

 Dùng tăm nhọn lấy mẫu nấm bệnh cho vào ống eppendorf bên trên (lượng lấy cỡ đầu một que diêm).

 Dùng chày nhựa nghiền nát sinh khối sợi nấm trong ống eppendorf  Bổ sung thêm 450µl đệm chiết vào ống eppendorf bên trên

 Hỗn hợp được trộn đều, đem ủ ở 60°C trong 30 phút đến 1 giờ

 Sau đó bổ sung thêm 200µl natri acetate 5M, trộn đều và ly tâm ở 12000vòng/phút, trong 30 phút, ở 4°C.

 Dịch nổi được chuyển sang một ống Eppendorf mới và bổ sung isopropanol lạnh để tủa DNA. Để ở nhiệt độ phịng 5 phút. Sau đó đem ly tâm ở 12000vòng/phút, 15 phút, 4°C

 Đổ bỏ phần dịch trong nhẹ nhàng, tủa được rửa trong 1000µl ethanol 70%  Ly tâm ở 10000v/phút, 10 phút, 4°C, sau đó để khơ và bổ sung thêm 50µl TE

Sản phẩm được điện di trên gel agarose 1% được chuẩn bị bằng đêm TAE và chứa 0,5 mg/mL ethidium bromide

Phản ứng PCR nhân trình tự

Khuếch đại vùng bảo thủ của ITS rRNA với cặp mồi có Trình tự cặp mồi: ITS1 : 5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ITS4 : 5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ Thành phần phản ứng: Nước : 6µl Master mix (2X) : 10µl ITS1 : 1µl ITS4 : 1µl

AND : 2µl Tổng thể tích : 20µl

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:

Biến tính: 95°C - 5 phút.

Tiếp đến 30 chu kỳ: 94°C – 1 phút, 60°C – 30 giây, 72°C – 1phút. Tổng hợp cuối cùng:. 72°C – 7 phút.

Bảo quản ở 4°C

Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0.8%. Đun tan 0.8% agarose (dung dịch TAE 10X 8ml, nước cất 2 lần 72ml, agarose 0,64g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong dung dịch TAE 1X. Nhỏ mẫu DNA vào giếng và chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cường độ dòng điện 90 mA trong 30 phút. Vớt ra và quan sát trong máy soi gel.

Tách chiết DNA chủng vi khuẩn, xạ khuẩn

DNA của vi khuẩn, xạ khuẩn được tách chiết theo phương pháp Marmur (1961) và Saito (1963) mô tả và cải tiến, thực hiện các bước như sau:

Xạ khuẩn được nuôi trong môi trường Gause-1 lỏng trong 5 ngày ở 30°C sau đó ly tâm 10000 vịng/phút trong 5 phút để thu tế bào.

Sinh khối xạ khuẩn được hòa tan trong 250 µl TE, trộn đều bằng cách vortex.

Bổ sung 50 µl dung dịch 10% SDS + 20 µl proteinase K lắc đều. Ủ 30 phút ở 65°C, 5 phút đảo 1 lần.

Bổ sung 400 µl CTAB, ủ ở 65C trong 30 phút, 5 phút đảo 1 lần.

Bổ sung 600 µl dung dịch Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1), lắc đều, ly tâm 13000 vòng, 10 phút, 4C.

Hút 500 µl dịch trong. Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch trong (v ml).

Bổ sung V= v(ml) dung dịch Chloroform:Isoamyl Alcohol (24:1) vào dịch trong thu được từ bước trên, ly tâm 13000 vòng/phút trong10 phút.

Hút dịch trong.

Tủa bằng ethanol 100%, lạnh.

Bay hơi và hòa tan DNA trong nước khử ion, bảo quản ở -20C.

Phản ứng PCR nhân trình tự 16S rRNA đặc thù cho xạ khuẩn

Cặp mồi 27F và 1492R được sử dụng để nhân đoạn gene 16S rRNA từ DNA của xạ khuẩn:

Trình tự cặp mồi: 27F : 5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 1492R : 5’- GGTTACCTTGTTACCACTT-3’ Thành phần phản ứng: Nước : 6µl Master mix (2X) : 10µl 27F : 1µl 1492R : 1µl DNA : 2µl Tổng thể tích : 20µl

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:

- Biến tính: 95°C - 5 phút.

- Tiếp đến 30 chu kỳ: 95°C – 45giây, 53°C – 55 giây, 72°C – 2 phút. - Tổng hợp cuối cùng:. 72°C – 2 phút.

- Bảo quản ở 4°C

Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0.8%. Đun tan 0.8% agarose (dung dịch TAE 10X 8ml, nước cất 2 lần 72ml, agarose 0,64g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong dung dịch TAE 1X. Nhỏ mẫu DNA vào giếng và chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cường độ dòng điện 90 mA trong 30 phút. Vớt ra và quan sát trong máy soi gel.

- Phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại

Đối với chủng nấm bệnh, so sánh mức độ tương đồng về trình tự gen mã hóa ITS rRNA của chủng nghiên cứu với các chủng đã công bố trên ngân hàng gen. Đối với chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, so sánh mức độ tương đồng về trình tự gen mã hóa rRNA 16S của chủng nghiên cứu với các chủng đã công bố trên ngân hàng gen sử dụng công cụ tra cứu Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), công cụ ClustalX2 và phần mềm MEGA7.

để tìm và chọn ra các chủng chuẩn đã cơng bố có mức độ tương đồng cao với chủng nghiên cứu. Truy cập vào cơ sở dữ liệu DNA của ngân hàng gen để tải các trình tự đó về. Căn trình tự để nhận biết các đoạn trình tự giống nhau giữa trình tự DNA truy vấn và trình tự DNA của các lồi đã biết trên ngân hàng gen.

Tiến hành xây dựng cây phân loại dựa trên trình tự gen đã được định dạng đúng với phần mềm. Sử dụng phần mềm MEGA7 để xây dựng cây xác định mối quan hệ di truyền, lựa chọn phương pháp Maximum Parsimony với độ tin cậy được tính bằng thuật tốn Bootstrap với 1000 lần lặp lại. Dựa vào cây phân loại và giá trị bootstrap để xác định mối quan hệ di truyền của chủng nghiên cứu.