I. TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP
2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.Vật liệu
2.1.Vật liệu
Nguyên liệu
Huyết thanh được thu từ máu nguyên của bệnh nhân ĐTĐT2 (30 mẫu được lựa chọn từ 100 mẫu) ở các giai đoạn bệnh khác nhau gồm có: (1) 9 mẫu ở giai đoạn sớm (nồng độ đường huyết từ 6-7 mmol/l); (2) 16 mẫu ở giai đoạn nhẹ (nồng độđường huyết lúc đói trên 7 và lúc no trên 11 mmol/l, chưa có biến chứng và (3) 5 mẫu ở giai đoạn nặng nồng độ đường huyết lúc đói >14 và lúc no >20 mmol/l và đã xuất hiện các biến chứng của bệnh (dựa theo nồng độđường huyết lúc đói và nghiệm pháp tăng đường huyết sau 2 giờ uống glucose và tình trạng có/chưa xuất hiện các biến chứng của bệnh…), ở các lứa tuổi khác nhau được cung cấp/thực hiện bới Bệnh viện Nội tiết Trung ương, được giã đông ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
Huyết thanh của mẫu người bình thường được tuyển chọn bởi đề tài có nồng độ đường huyết ở mức độ bình thường (4-6 mmol/l).
Hóa chất và thiết bị
Các hóa chất được sử dụng cho điện di SDS-PAGE, điện di hai chiều, sắc ký lỏng nano và phản ứng Western blotting đều được cung cấp bởi các hãng nổi tiếng, có độ tinh sạch cần thiết cho sinh học phân tử như: methanol (Merck-Đức) acetonitrile (ACN) được mua từ J.T Barker (Pittsburgh, Mỹ); formic acid (FA), trifluor acetic acid (TFA) của Fluka (Fluka Chemie GmbH, Buchs, Switzerland); dithiothreitol (DTT), iodoacetamide (IAA), enzyme trypsin, Anti-human haptoglobin in chicken, Anti-Chicken lgY(lgG) (wholemolecule- Peroxidase antibody produced in chicken mua từ Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Mỹ). Các hóa chất dùng cho điện di mua từ Bio-Rad (Hercules, Mỹ).
Hệ thống máy sử dụng có độ tin cậy cao như: Hệ thống máy khối phổ QSTAR XL MS/MS (AppliedBiosystem/MDS Sciex, Toronto, Canada), sắc ký lỏng nano (bao gồm cột SCX, cột Reversed Phase trap, cột C18) được cung cấp bởi LC Packings/Dionex (Amsterdam, Nertherland), điện di 1 chiều, 2 chiều, hệ thống chuyển màng của Bio–Rad cùng với các trang thiết bị khác của Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
96
2.1. Phương pháp nghiên cứu
Bước 1: Xác định nồng độ protein trong huyết thanh bằng phản ứng Bradford
Nồng độ protein trong huyết thanh được xác định bằng phản ứng Bradford với thuốc nhuộm protein được cung cấp bởi hãng Biorad (Mỹ) để sao cho nồng độ protein trong huyết thanh của mẫu bệnh ĐTĐT2 và mẫu đối chứng đưa lên mỗi giếng chạy điện di SDS-PAGE là như nhau. Các bước tiến hành như sau:
• Chuẩn bị 7 nồng độ protein chuẩn BSA: 0; 0,25; 0,5; 0,75; 1; 1,25; 1,5 (mg/ml), cho vào các ống eppendorf 2ml.
• Trước khi sử dụng vài phút, lấy thuốc nhuộm 1x từ tủ 40C và để ở nhiệt độ thường.
• Pha loãng mỗi nồng độ BSA với dung dịch thuốc nhuộm theo tỷ lệ 1:50 (20µl BSA được pha loãng với 980µl dung dịch Bradford 1x), để phản ứng xảy ra khoảng 5 phút ở nhiệt độ phòng. Các mẫu không nên ủ quá 1h ở nhiệt độ phòng.
• 10µl mỗi mẫu huyết thanh nguyên (30 mẫu bệnh ĐTĐT2 và 30 mẫu đối chứng) được pha loãng với H20 theo tỷ lệ 1:20
• Sau đó, 20µl huyết thanh đã được pha loãng được trộn với 980µl dung dịch thuốc nhuộm 1x theo tỷ lệ 1:50, để phản ứng xảy ra khoảng 5 phút ở nhiệt độ phòng. Các mẫu không nên ủ quá 1h ở nhiệt độ phòng.
• Đặt máy quang phổ ở bước sóng 595 nm, đo độ hấp thụ của các dung dịch BSA và mẫu huyết thanh nghiên cứu, ghi kết quả và dựng đường chuẩn BSA, từđó suy ra nồng độ dung dịch protein cần xác định.
Bước 2: Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE
Điện di SDS-PAGE được thực hiện theo Laemmli UK, 1970 (Laemmli UK, 1970) với các thiết bị của hãng Bio-Rad. Để phân tách các protein có trọng lượng phân tử từ 12 - 68 kDa gel 10%, 12,5% và 15% (w/v) được sử dụng. SDS-PAGE được tiến hành trên gel 12,6% nhưở Bảng 21.
Bảng 21. Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE
Thành phần
Gel cô 5% 2 ml: 0,5 ml 0,5 M Tris-HCl pH 6,8; 10 µl 10% (w/v) SDS; 0,35 ml 30% (w/v) acrylamide; 1,3 ml H2O; 20 µl 10% (w/v) APS; 2 µl TEMED Gel phân tách
12,6%
4,5 ml: 1,125 ml 1,5 M Tris-HCl pH 8,8; 45 µl 10% (w/v) SDS; 0,9 ml 50% glycerol; 1,89 ml 30% (w/v) acrylamide; 0,55 ml H2O; 30 µl 10% (w/v) APS; 3 µl TEMED
Đệm mẫu 5x 25% (v/v) glycerol; 14,4 mM β-mercaptoethanol; 2% (w/v) SDS; 0,1 (w/v) bromophenol blue; 60 mM Tris-HCl pH 6,8
97 Đệm điện di 25 mM Tris-HCl; 192 mM glycine; 0,1% (w/v) SDS; pH 8,3
Thang protein chuẩn (kDa)
β-galactosidase (116), albumin huyết thanh bò (66.2), ovalbumin (45), lactate dehydrogenase (35), endonuclease giới hạn (25), lysozyme (14.4) Sau đó, lấy khoảng 20µl huyết thanh (đã pha loãng 20 lần), (tùy từng mẫu) của mỗi mẫu bệnh ĐTĐT2 (30 mẫu) và mẫu đối chứng (30 mẫu) sao cho nồng độ protein đưa lên mỗi giếng phải như nhau (khoảng 50µg protein huyết thanh).
Tiến hành điện di biến tính SDS-PAGE ở hiệu điện thế 110V, trong 2h, ở nhiệt độ phòng để phân tách protein theo khối lượng.
Để phân tích mức độ biểu hiện của protein, các bản gel được nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue (CBB). Sau khi ủ với dung dịch nhuộm [0,1% (w/v) CBB, 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid] trong 30 phút, bản gel được tẩy rửa bằng dung dịch tẩy [30% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid] cho đến khi có thể quan sát thấy các băng protein.
Bước 3: Phản ứng Western-blotting
Sau khi điện di biến tính trên gel polyacrylamide 12,6%, bản gel được cân bằng với dung dịch đệm chuyển (25 mM Tris-HCl, 192 mM glycine, 20% methanol, pH 8,3) trong 15 phút.
• Màng PVDF cùng với giấy lọc có kích thước bằng kích thước của bản gel được ngâm rửa bằng dung dịch đệm chuyển (25 mM Tris-HCl, 192 mM glycine, 20% methanol, pH 8,3) trong 15 phút.
• Tiến hành thấm chuyển từ gel sang màng trong thiết bị lai (Minitransbloter) ởđiều kiện 100V, 1 giờ, 4oC.
• Sau đó màng được ủ trong dung dịch TBS (Tris buffered saline: 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 7,5) với 5% sữa loại mỡở 4oC, 16 giờ.
• Rửa màng bằng đệm TTBS (TBS, 0,05% Tween 20) 2 lần, 5 phút/lần.
• Lai màng với kháng thể thứ nhất (15µl Anti-human haptoglobin in chicken được cung cấp bới hãng Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Mỹ)) trong 2 giờ (ngâm lắc màng lai trong dung dịch TBS bổ sung kháng thể thứ nhất với tỷ lệ 1000:1).
• Tiếp tục rửa màng bằng đệm TTBS (2 lần), 5 phút/lần.
• Lai tiếp màng với kháng thể thứ hai [15µl Anti-Chicken lgY(lgG) wholemolecule- Peroxidase antibody produced in chicken được cung cấp bới hãng Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Mỹ)] 2 giờở nhiệt độ phòng.
• Màng PVDF được hiện màu trong hỗn hợp H2O2 và 4-chloro-1-naphthol (60µl TBS lạnh chứa 20% methanol, 30mg 4-chloro-1-naphthol, 10µl 30% H2O2).
98