20 gi|183581 Q9NQ66 phosphoinositide-specific phospholipase Cbeta1 isoform a
1.4.3.2.3. CSDL hệ glycoprotein trong mẫu huyết thanh người bệnh leukemia dạng mãn (8 mẫu, 141 protein)
(8 mẫu, 141 protein)
CSDL hệ glycoprotein huyết thanh bệnh nhân leukemia dạng mãn được xây dựng với tổng số 141 glycoprotein. Trong CSDL này có sự phù hợp về số lượng, về chủng loại các glycoprotein so với các CSDL hệ glycoprotein huyết thanh bệnh nhân leukemia dạng cấp và người bình thường. Trong số các glycoprotein thì Novel cellular proto-oncogene (với mã Uniprot ID là Q12866) là một protein đáng chú ý. Protein này còn có tên khác là Mer (hoặc MerTK), đã được nghiên cứu và chứng minh có sự biểu hiện quá mức ở bệnh leukemia. Mer là một receptor tyrosine kinase rất quan trọng cho quá trình tập hợp của các tiểu cầu. Mer biểu hiện không bình thường ở các tế bào tuyến ức hoặc các tế bào lympho. Mer có thể là một đích quan trọng cho liệu pháp điều trị bệnh leukemia. (Keating AK et al, 2006).
Nhận xét chung về các CSDL hệ protein huyết thanh bệnh nhân leukemia dạng cấp và mãn
Nhìn chung thành phần protein huyết thanh bệnh nhân leukemia dạng cấp và mãn đều có điểm chung là ngoài những protein bình thường tham gia các hoạt động sống của cơ thể còn chứa khá nhiều các protein liên quan đến bệnh lý: (i) bệnh leukemia; (ii) bệnh ung thư; (iii) các protein đột biến; (iv) các protein lai (fusion protein).
Tỷ lệ xuất hiện các protein này trong mẫu bệnh leukemia ở cả 2 thể bệnh cấp và mãn đều cao hơn người bình thường (thống kê trong Bảng 19).
Các protein liên quan đến ung thư
Trong CSDL hệ protein tổng thể: tỉ lệ các protein liên quan đến ung thư tăng từ 1,92% ở người bình thường lên 4,26% ở người bệnh leukemia cấp và 4,61% ở người bệnh leukemia mãn, nghĩa là tăng khoảng 1,9 – 2,5 lần.
Trong CSDL hệ protein bền nhiệt: tỉ lệ các protein liên quan đến ung thư cũng tăng từ 1,8% số protein ở người bình thường lên 4,64% ở người bệnh leukemia dạng cấp và 3,76% ở người bệnh leukemia dạng mãn, nghĩa là tăng khoảng từ 2,1 đến 2,5 lần.
Các protein đột biến
Trong CSDL hệ protein tổng thể: tỉ lệ các protein đột biến ở người bình thường là 0,46%, trong khi ở người bệnh leukemia cấp là 0,95% và mãn là 0,8% nghĩa là tăng khoảng 2 lần ở người bệnh.
Trong CSDL hệ protein bền nhiệt: tỉ lệ các protein đột biến ở người bình thường là 0,23% trong khi ở người bệnh leukemia cấp là 1,27% và mãn là 1%, nghĩa là tăng khoảng từ 4-5 lần ở người bệnh.
Như vậy có thể thấy sự gia tăng tỷ lệ các protein liên quan đến ung thư và đột biến trong mẫu huyết thanh bệnh nhân leukemia cho thấy số lượng của chúng trong huyết thanh
86 người bệnh đã tăng lên đáng kể so với mẫu người bình thường. Đây có thể là những dẫn liệu quan trọng trong việc tìm kiếm các chỉ thịđặc trưng cho bệnh leukemia.
Bảng 19. So sánh tỷ lệ các protein liên quan đến bệnh ung thư và tỷ lệ protein dạng đột biến giữa các cơ sở dữ liệu người bình thường và người bệnh leukemia.
Các protein liên quan đến các quá trình ung thư Các protein bịđột biến CSDL Đối tượng Số lượng protein Tổng số protein Tỷ lệ (%) Số lượng protein Tổng số protein Tỷ lệ (%) Người bình thường 71 3696 1,92 17 3696 0,46 Leukemia dạng cấp 162 3801 4,26 36 3801 0,95 Hệ protein tổng thể Leukemia dạng mãn 92 1994 4,61 16 1994 0,80 Người bình thường 25 1386 1,8 3 1308 0,23 Leukemia dạng cấp 135 2912 4,64 37 2912 1,27 Hệ protein bền nhiệt Leukemia dạng mãn 56 1489 3,76 15 1489 1,00
Trong số các protein đã được liệt kê, có thể kểđến một số protein đáng chú ý như:
Apolipoprotein AI (ApoAI) là các protein gắn với lipid, vận chuyển các phân tử lipid từ ruột đến gan, đóng vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp lipoprotein mật độ cao HDL (High Density Lipoprotein) (Sasaki J et al, 2000). Trong hệ tuần hoàn, ApoAI cũng đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa và loại cholesterol ra khỏi tế bào, vì thế những biến đổi của ApoAI có liên quan đến bệnh tim mạch. Người ta cũng cho rằng ApoAI điều chỉnh hoạt tính của các enzyme quan trọng trong cơ chế chuyển hóa lipoprotein. Sự thay đổi nồng độ ApoAI được coi như chỉ thị của nhiều loại ung thư khác nhau như ung thư vú (Huang HL et al, 2006), ung thư ruột kết (Tachibana et al, 2003), ung thư buồng trứng (Moore LEet al, 2005).
ApoAI được tìm thấy trong tất cả các mẫu thường, leukemia cấp và mãn, ở cả 2 dạng mẫu là hệ protein tổng thể và bền nhiệt. Tuy nhiên, điểm đáng lưu ý là trong tất cả các mẫu bệnh, ApoAI nhận diện được đều ở dạng đột biến giống nhau, trong khi ở người bình
87 thường ApoAI không bịđột biến. Một số nghiên cứu gần đây đã chứng minh các đột biến (đặc biệt là đột biến xảy ra ở các gốc cysteine) gây những biến đổi làm cho cấu trúc bậc hai bị yếu đi và mất chức năng của ApoAI (Soutar AK et al, 1992; Zhu X et al, 2005).
Protein bệnh ở chuỗi nặng HCD (Heavy Chain Disease) của Ig thường được phát hiện ở dạng ung thư tế bào B, được phân biệt bởi quá trình tạo chuỗi nặng Ig không liên kết với chuỗi nhẹ của tế bào B. Có 3 dạng bệnh chuỗi nặng phổ biến được phân biệt dựa trên các loại Ig khác nhau: IgA (α-HCD), IgG (γ-HCD), và IgM (µ-HCD). Trong đó α-HCD là dạng phố biến, còn γ- và µ-HCD thường hiếm khi xảy ra và chủ yếu tìm thấy ở các bệnh nhân ung thư máu dạng non-Hodgkin tế bào B tạo ra chuỗi nặng Ig bất thường. Những bệnh nhân này thường được chẩn đoán mắc bệnh gama đơn dòng với nguyên nhân không xác định. Khi kiểm tra huyết thanh và nước tiểu của các bệnh nhân ung thư bạch huyết non-Hodgkin, nhiều bệnh nhân có γ- hoặc µ-HCD (Witzig TE et al, 2002).
Trong nghiên cứu của chúng tôi, HCD được phát hiện thấy trong mẫu người bình thường ở cả 2 loại mẫu là tổng thể và bền nhiệt nhưng ở người bệnh chỉ phát hiện thấy ở mẫu tổng thể dạng mãn và bền nhiệt dạng cấp.
Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia protein là một họ protein được mã hóa bởi gen MLL nằm ở vùng 23 trên cánh dài NST số 11 (11q23). Các protein MLL thường là các protein lớn, gắn DNA, với nhiều vùng chức năng khác nhau, trong đó quan trọng nhất là tham gia điều khiển phiên mã thông qua quá trình acetyl hóa và methyl hóa histone. Ở bệnh nhân leukemia cấp, tần số đột biến, nhất là các đột biến chuyển đoạn NST liên quan đến gen MLL rất lớn và xảy ra ở tất cả các thể bệnh, đúng như tên gọi của nó. Có tới 75% trẻ sơ sinh mắc leukemia cấp được xác định là mang các đột biến loại này, tỷ lệ này thấp hơn trong các trường hợp Leukemia cấp ở người trưởng thành và trẻ lớn hơn (Pui CH et al, 2007). Gen MLL có thể tổ hợp với hơn 50 gen khác nhau (Pui CH et al, 2007), tạo ra các protein lai có đầu N được mã hóa bởi gen MLL, đầu C được mã hóa bởi gen lai với nó và hoạt động như những yếu tố tham gia vào quá trình phiên mã (Ayton PM et al, 2001; Nakamura T et al, 2002). Trong số các đột biến chuyển đoạn NST liên quan đến gen MLL, hay gặp nhất là đột biến t(4;11)(q21;q23), chiếm tới 40% tổng số các đột biến loại này (Heerema NA et al, 1994). Protein lai được tạo ra là MLL-AF4 gồm 2304 amino acid, trong đó đầu 1439 amino acid phía đầu N được mã hóa từ gen MLL và 865 amino acid còn lại phía đầu C được mã hóa bởi gen AF4 trên NST số 4 (Domer PH et al, 1993). MLL-AF4 được xem là một chỉ thị quan trọng trong chuẩn đoán và điều trị các thể bệnh leukemia. Một vài nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh MLL-AF4 làm tăng khả năng sống của các tế bào mang đột biến chuyển đoạn này (Kersey JH et al, 1998) và tăng cường sức chống chịu với quá trình apoptosis (Dorrie et al, 2002).
Các protein MLL được tìm thấy trong hầu hết các mẫu huyết thanh người thường và người bệnh leukemia nhưng đột biến MLL-AF4 chỉ thấy trên người bệnh, cụ thể là trong các mẫu tổng thể leukemia cấp và mãn, bền nhiệt leukemia cấp.
ALL-1 fusion partner from chromosome 6: Gen ALL-1 nằm trên nhiễm sắc thể 11q23, thường tồn tại trong dạng lai với nhiều gen khác thông qua quá trình chuyển đoạn nhiễm
88 sắc thể. ALL xuất hiện trong bộ gen của các bệnh nhân mắc bệnh leukemia cấp với hàm lượng khoảng 5-10% (Schichman SA et al, 1994). Một số nghiên cứu công bốđã cho thấy sự sắp xếp lại của gen ALL-1 đối với bệnh nhân AML đang tuổi trưởng thành (Schichman SA et al, 1994) cũng nhưđối với trẻ em (Felix CA et al, 1995).
Đây là protein không thấy xuất hiện trong tất cả các mẫu người bình thường nhưng lại có trong hệ protein bền nhiệt dạng cấp và mãn, hệ glycoprotein dạng cấp của bệnh nhân leukemia.
ERBB4 (V-erb-a erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 4 isoform JM-a/CVT-1
precursor hay Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4) là 1 enzyme được mã hóa bởi gen ERBB4 (Zimonjic DB et al, 1995). ERBB4 là một protein xuyên màng 1 lần với các tiểu phần giàu cysteine có cấu trúc phức tạp tương tự furin, vùng liên kết với phosphotidylinositol-3 kinase và PDZ. Protein này được hoạt hóa bởi liên kết với neuregulins-2, neuregulin-3, HB-EGF (heparin-binding EGF-like growth factor), betacellulin. Các nghiên cứu đã cho thấy, sựđột biến của gen tổng hợp protein này có liên quan đến bệnh ung thư (Soung YH et al, 2006; Naresh A et al, 2006; Zhu Y et al, 2006). Ở người bình thường, ERBB4 chỉđược tìm thấy trong mẫu glycoprotein, trong khi ở người bệnh, chúng tôi bắt gặp ở cả mẫu glycoprotein dạng cấp, tổng thể dạng cấp, tổng thể dạng mãn và bền nhiệt dạng cấp.
AML1-EVI-1 fusion protein: Gen AML/EVI-1 được tạo ra bởi chuyển đoạn nhiễm sắc thể t(3;21) và (q26;q22). Gen này mã hóa cho protein lai AML/EVI-1 là đóng vai trò then chốt trong sự phát triển của các khối u ác tính ở bệnh ung thư như leukemia. Trong phân tử AML1/EVI-1, đầu N của protein AML1 chứa một tiểu phần tương đồng có khả năng liên kết với tiểu phần ngón tay kẽm của protein EVI-1. Mitani K đã nghiên cứu và tìm ra vai trò của AML1/EVI-1 trong cơ chế chung của bệnh leukemia. Protein lai này tăng cường hoạt động của AP-1 bằng cách hoạt hóa promoter c-Fos phụ thuộc vào tiểu vùng ngón tay kẽm của phân tử EVI-1 và điều khiển quá trình tăng sinh nhanh chóng của tế bào (Mitani K et al, 2004). Đã có nhiều nghiên cứu khác cho thấy sự liên quan và cơ chế của AML1/EVI-1 trong quá trình hình thành và phát triển của bệnh leukemia cấp tính (Okuda T et al, 1996; Sood R et al, 1999).
Đây là protein không thấy xuất hiện trong tất cả các mẫu người bình thường nhưng lại có trong hệ protein tổng thể dạng cấp và mãn, hệ protein bền nhiệt dạng cấp của bệnh nhân leukemia.
HSP90 (heat shock protein 90 alpha) cùng các đồng phân khác của nó được tìm thấy khá nhiều trong các mẫu bệnh Leukemia ở cả dạng cấp và mãn, với 2 loại mẫu là bền nhiệt và tổng thể, một sốđồng phân cũng tìm thấy trong mẫu tổng thể người bình thường nhưng với tỷ lệ thấp hơn. Một số nghiên cứu trên các tế bào ung thư bạch cầu cấp tính AML và ALL có sự chuyển đoạn nhiễm sắc thể t(4;11) đã chứng minh là có sự biểu hiện quá mức của HSP90 khi so sánh với dòng tế bào đối chứng CD34+ (Yocum AK et al, 2006).
89
CREB là một trong số rất nhiều gen đã được phát hiện có mức độ biểu hiện mRNA bất thường liên quan tới bệnh bạch cầu. Sản phẩm biểu hiện của gen này là protein CREB- binding protein, được xem nhưđích đến của các loại thuốc dùng điều trị bệnh. CREB điều khiển các gen chịu trách nhiệm cho các quá trình tăng trưởng, biệt hóa và sự sống sót của tế bào. CREB được phát hiện biểu hiện thừa cả ở mức độ phiên mã mRNA và protein trong tủy xương ở hầu hết những bệnh nhân bị ung thư bạch cầu cấp tính và được xem là có vai trò như một chỉ thị theo dõi diễn biến bệnh ung thư bạch huyết (AML) (Cheng JC et al, 2007). CREB-binding protein và đồng phân CREB-binding protein isoform a của nó được tìm thấy trong tất cả các mẫu bệnh leukemia ở cả dạng cấp và mãn, dạng bền nhiệt và tổng thể nhưng ở người thường chỉ phát hiện được trong các mẫu bền nhiệt.
PLCβ1 (inositide-specific phospholipase C) Nghiên cứu của Bavelloni A et al sử dụng phương pháp điện di hai chiều kết hợp với kỹ thuật khối phổ MALDI-TOF MS cũng thông báo rằng sự biểu hiện quá mức của PLCβ1 (inositide-specific phospholipase C, đồng dạng chính định vị trong nhân) đã dẫn tới hiện tượng điều chỉnh xuống mức độ biểu hiện của protein SRp20 (một protein định vị trong nhân tế bào, là thành viên của một họ các protein điều chỉnh việc gắn nối mRNA (splicing) giàu acid amine serine-arginine) (Bavelloni A et al, 2006).
Đây là protein không thấy xuất hiện trong tất cả các mẫu người bình thường nhưng lại có trong hệ protein tổng thể dạng cấp và mãn, hệ protein bền nhiệt dạng cấp và mãn của bệnh nhân leukemia.
PML-RARα (Promyelocytic leukemia - retinoic acid receptor-α) là sản phẩm của sự chuyển đoạn nhiễm sắc thể t(15;17) (Grignani F et al, 1999). Protein này là dấu hiệu phân tử của bệnh ung thư bạch cầu bạch huyết (Acute promyelocytic leukemia) đồng thời đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh bệnh ung thư bạch cầu do những phá hỏng chức năng bình thường của cả hai con đường (pathways) PML và RARα (Kakizuka A, 1991 và Melnick A et al, 1999). Những nghiên cứu in vivoở chuột chuyển gen và in vitro
ở các tế bào máu chứng minh ảnh hưởng của protein lai PML-RARα tới kiểu hình bệnh bạch cầu do ức chế sự biệt hóa và kích thích sự sống sót của các tế bào tiền thân tạo máu (Wang ZG et al, 1998, Zhong S et al, 2000). Ảnh hưởng trực tiếp của sự biểu hiện protein lai PML-RARα lên toàn bộ mức độ biểu hiện các protein của dòng tế bào ung thư bạch huyết U937/ PML-RARαđã được Zada và cs. phân tích dựa trên các phương pháp điện di hai chiều và khối phổ (MALDI TOF TOF) (Zada, AAP et al, 2006). Kết quả cho thấy, trong số 224 protein được nhận diện nhờ khối phổ có tới 47 protein bị thay đổi mức độ biểu hiện do ảnh hưởng của protein lai PML-RARα.
Trong nghiên cứu của mình, chúng tôi cũng tìm thấy sự có mặt của protein lai PML-RARα trong mẫu protein bền nhiệt của bệnh nhân leukemia, trong đó, ngoài thể bệnh AML3 (Acute promyelocytic leukemia), còn bắt gặp protein này trong thể AML4 và một số bệnh nhân mãn tính (CML).
MTHFR (Methylenetetrahydrofolate reductase) là một enzym liên quan trong sự trao đổi chất folate và methyl hóa DNA (DNA methylation). Người ta đã chứng minh rằng biến thể
90 đồng hợp tử MTHFR 1298CC liên quan chặt chẽ tới việc làm tăng nguy cơ mắc bệnh CML và kiểu gen MTHFR 677CC và 1298CC có ảnh hưởng tới nguy cơ mắc bệnh CML và AML (Moon HW et al, 2007). Điều đáng chú ý là trong các mẫu được phân tích, chúng tôi nhận thấy MTHFR chỉ có trong hệ protein bền nhiệt bệnh leukemia cấp và một đồng phân khác của nó là 5,10-methylenetetrahydrofolat reductase được tìm thấy trong mẫu tổng thể dạng mãn, các hệ protein người bình thường đều không thấy protein này.
Tysosine kinase 3 kiểu FMS/một tysosine kinase xuyên màng (FLT3 - Fetal Liver Tyrosine Kinase 3) được biểu hiện ở hầu hết các trẻ bị ung thư máu ác tính và được xem như một đích tiêu biểu trong điều trị bệnh ung thư máu ác tính. (Stubbs MC and Armstrong SA., 2007). Trong nghiên cứu của mình, chúng tôi không tìm thấy FLT3 nhưng phát hiện được dạng phosphoryl hóa của nó là TYRO3 trong các mẫu leukemia cấp dạng bền nhiệt và tổng thể, ở người bình thường và các bệnh nhân leukemia thể mãn đều không bắt gặp protein này. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh rằng không có sự khác biệt đáng kể nào về mức độ của các protein FLT3 có mặt trong huyết thanh các bệnh nhân leukemia cấp nhưng các bệnh nhân AML có tỉ lệ FLT3 phosphoryl hóa/FLT3 cao hơn một cách có ý nghĩa với độ tin cậy lên tới 98%. Protein FLT3 phosphoryl hóa được phát hiện thấy cao hơn một cách đáng kể trong plasma của những người bệnh mang các đột biến của FLT3 với mức độ tin cậy là 99.98%. Nhìn chung không có mối liên quan giữa sự sống của bệnh nhân và mức độ protein FLT3 hoặc dạng phosphoryl hóa của nó trong huyết thanh. Tuy nhiên, trong số các bệnh nhân không có các đột biến của FLT3, những bệnh nhân nào có mức độ phosphoryl hóa của FLT3 cao hơn thì có thời gian thuyên giảm bệnh ngắn hơn