(protein markers)
Để có thể nhận dạng, xác định các ứng viên chỉ thi protein trong huyết thanh bệnh nhân ĐTĐT2 và leukemia, chúng tôi đã sử dụng phương pháp điện di 2 chiều phân tích hình ảnh, mức độ biểu hiện của các protein (hệ protein bền nhiệt, hệ glycoprotein) trong trạng thái bình thường và bệnh lý. Các protein có biểu hiện thay đổi trong mẫu bệnh (tăng, giảm, biến mất, xuất hiện mới) được phân tích, nhận dạng. Trên cơ sở số lượng mẫu phân tích là 30 đối với các trường hợp người bình thường và người bệnh, chúng tôi đã tìm được một số protein có biểu hiện thay đổi khá đặc trưng ở các mẫu bệnh. Đây là các ứng viên có thể nghiên cứu phát triển thành chỉ thị chẩn đoán bệnh.
2.1. Phân tích, nhận dạng và xác định các protein có thay đổi về mức độ biểu hiện hoặc cấu trúc liên quan đến sự phát triển của bệnh của bệnh ĐTĐT2 hoặc cấu trúc liên quan đến sự phát triển của bệnh của bệnh ĐTĐT2
Với mục đích tìm kiếm các protein có biến đổi đặc trưng trong mẫu bệnh để có thể phát triển thành chỉ thị chẩn đoán bệnh, nhất là bệnh ở giai đoạn sớm, 30 mẫu huyết thanh bệnh nhân ĐTĐT2 đã được lựa chọn bao gồm 9 mẫu giai đoạn sớm, 16 mẫu giai đoạn nhẹ và 5 mẫu giai đoạn nặng.
Nhưđã trình bày ở phần Nội dung 1, các mẫu huyết thanh bệnh nhân và người bình thường được xử lí, phân tách thành các hệ protein tổng thể, bền nhiệt và glycoprotein. Các hệ protein bền nhiệt và hệ glycoprotein được tiến hành điện di 2DE để tìm các protein có biến đổi về mức độ biểu hiện và sử dụng phần mềm PDQuest để tính toán % thay đổi so với mẫu đối chứng. Ở các bệnh nhân ĐTĐT2 chúng tôi đã tìm thấy 8 protein có biểu hiện thay đổi có ý nghĩa thống kê với (p≤ 0.05) đáng chú ý (Bảng 20).Trong số 8 protein này có đến 3 protein thuộc nhóm Haptoglobin với các đồng phân khác nhau có biểu hiện tăng ởđa số mẫu bệnh ở cả 3 giai đoạn là Chuỗi haptoglobin alpha 1 (HpA1); Chuỗi haptoglobin alpha 2 (HpA2); Chuỗi haptoglobin beta (HpB), trong đó HpA1, HpA2 có mức độ biểu tăng ở 25/30 và 22/30 mẫu huyết thanh bệnh nhân đã phân tích. Mức độ biểu hiện của của các đồng phân Hp được tăng dần theo các giai đoạn của bệnh, nhìn chung tăng khỏang 2 lần so với đối chứng (xấp xỉ 200%). Ví dụ HpA1 từ 127% ở giai đọan sớm lên 166,4% ở giai đọan nhẹ và tới 219,5% ở giai đoạn nặng. Trong số 3 đồng phân của Hp thì HpA1 có biểu hiện thay đổi tăng ở các giai đoạn của bệnh rõ nhất, còn HpB có mức độ thay đổi ở các giai doạn bệnh nhỏ nhất (192,3% giai đoạn sớm, 200,3% giai đọan nhẹ và 214% giai đọan nặng).
Các protein còn lại có biểu hiện thay đổi ở các mẫu bệnh nhưng mức độ lặp lại không cao. Tranthyretin (TTR) chỉ thay đổi mức độ biểu hiện ở các hệ protein bền nhiệt, ở bệnh nhân giai đoạn sớm và nặng có biểu hiện tăng, còn ở giai đoạn nhẹ lại có biểu hiện giảm. TTR đang được chúng tôi nghiên cứu sâu hơn để tìm hiểu mối liên quan của protein này đến sự hình thành và phát triển của bệnh ĐTĐT2.
92 Dựa vào các kết quả đã nhận được, chúng tôi đã phát triển phương pháp ứng dụng Haptoglobin trong phối hợp chẩn đoán sớm bệnh ĐTĐT2 bằng phương pháp Western Blotting sử dụng kháng thể kháng Haptoglobin.
Bảng 20. Danh sách một số protein có mức độ biểu hiện thay đổi ở trong huyết thanh bệnh nhân ĐTĐT2. Mức độ biểu hiện ở bệnh ĐTĐT2 (% tăng hoặc giảm so với mẫu bình thường là 100%) ST T Tên protein GĐ sớm (n=9) GĐ nhẹ (n=16) GĐ nặng (n=5) Tần số xuất hiện biến đổi
1 Chuỗi haptoglobin alpha 1 (HpA1) Tăng (7/9) 127 ± 6,8 Tăng (15/16) 166,4 ±16,6 Tăng (3/5) 219,5±2,2 25/30
2 Chuỗi haptoglobin alpha 2 (HpA2) Tăng (8/9) 177,2±28,9 Tăng(10/16) 236,7±122 Tăng (4/5) 248,5±66,8 22/30
3 Chuỗi haptoglobin beta (HpB) Tăng (4/9) 192,3±11,6 Tăng (5/16) 200,3±56,2 Tăng (2/5) 214±42,3 11/30 4 Tranthyretin (TTR) (Chỉở mẫu bền nhiệt) Tăng (2/9) Giảm (7/16) Tăng (1/5) Tăng: 2/30 Giảm: 8/30 5 Acid alpha 1 glycoprotein
(Acid A1G) Tăng (5/16) Tăng (1/5) 6/30 6 Fibrinogen (Chỉở mẫu glycoprotein) Tăng (4/9) Tăng (3/16) Tăng (1/5) 8/30 7 Prolypoprotein (Proapo) Chỉở mẫu glycoprotein) Tăng (1/16) Tăng (1/5) 2/30 8 Apolypoprotein CII và CIII (ApoC II và III)
Tăng (1/9) Tăng (2/16) Tăng (2/5) 5/30
(Độ tin cậy: p≤ 0.05)
2.2. Phân tích, nhận dạng và xác định các protein có thay đổi về mức độ biểu hiện hoặc cấu trúc liên quan đến sự phát triển của bệnh leukemia hoặc cấu trúc liên quan đến sự phát triển của bệnh leukemia
Tương tự như trường hợp bệnh ĐTĐT2, đối với trường hợp bệnh leukemia chúng tôi cũng đã tiến hành xử lí, phân tách các mẫu huyết thanh và điện di 2DE để tìm kiếm, phát hiện các protein có biểu hiện thay đổi trong các trạng thái bệnh. Các protein này sau đó được
93 nhận dạng bằng phương pháp khối phổđể xác định tên, khối lượng phân tử và các thông số liên quan.
Các protein có biến đổi về mức độ biểu hiện trên hình ảnh điện di 2DE các mẫu huyết thanh bệnh nhân leukemia dạng cấp
Như đã trình bày trong phần kết quả của Nội dung 1, bằng phương pháp điện di 2DE và khối phổ, chúng tôi đã phân tích và nhận diện được một số protein có sự thay đổi mức độ biểu hiện ở mẫu bệnh leukemia dạng cấp so với các mẫu đối chứng là người bình thường, tuy nhiên sự thay đổi khá phức tạp, cùng một protein có khi biểu hiện tăng, khi giảm và khi lại biến mất ở các thể bệnh khác nhau của thể cấp, không có độ lặp lại cao ở các mẫu có thể do quá trình diễn biến của bệnh leukemia cấp nhanh và phức tạp. Mặt khác thể cấp của bệnh leukemia bao gồm khá nhiều dạng khác nhau, do đó để có thể nghiên cứu một cách hệ thống, có lẽ chỉ nên tập trung vào một trong các dạng cấp để tập trung hơn. Trên thực tế, việc thu thập, tuyển chọn các mẫu bệnh leukemia cũng đòi hỏi các tiêu chí, các chỉ tiêu chẩn đoán bệnh chặt chẽ về mặt tế bào học, các chỉ tiêu huyết học, phân tích nhiễm sắc thể, hình thái tế bào, các CD miễn dịch... nên quá trình tuyển chọn mẫu cũng khá khó khăn với điều kiện bệnh nhân chưa điều trị của đề tài. Vì vậy, đối với trường hợp bệnh cấp, bằng phương pháp điện di 2DE, chúng tôi chưa tìm được các biến đổi đặc trưng của một protein nào.
Bên cạnh đó bằng phương pháp phân tích khối phổ, trong các CSDL hệ protein huyết thanh bệnh nhân leukemia dạng cấp (Xem kết quảở phần Nội dung 1) chúng tôi đã tìm thấy khá nhiều protein có liên quan đến bệnh leukemia, liên quan đến các bệnh ung thư, các protein đột biến, các protein lai... có khả năng liên quan đến sự phát sinh và phát triển của bệnh leukemia.
Các protein có biến đổi về mức độ biểu hiện trên hình ảnh điện di 2DE các mẫu huyết thanh bệnh nhân leukemia dạng mãn
Tương tự, như đã trình bày trong phần kết quả của Nội dung 1, bằng phương pháp điện di 2DE và khối phổ, chúng tôi đã phân tích và nhận diện được một số protein có sự thay đổi mức độ biểu hiện ở mẫu bệnh leukemia dạng mãn so với các mẫu đối chứng là người bình thường. Không giống dạng cấp, kết quả phân tích trên tổng số 8 mẫu leukemia dạng mãn cho thấy, sự biến đổi mức độ biểu hiện của 6 protein (Bảng 8, tr. 60) có độ lặp lại cao trên các mẫu đã phân tích. Sự biểu hiện của alpha1 antitrypsin tăng ở 7/8 mẫu (còn 1 mẫu không thấy có sự thay đổi); Ceruloplasmin tăng ở tất cả 8/8 mẫu. Haptoglobin alpha 2 chain giảm ở tất cả 7/8 mẫu; trong khi đó Haptoglobin β chain, Zinc-α2 –glycoprotein và Complement C3 đều giảm ở tất cả 8/8 mẫu. Như vậy có thể nhận thấy bằng phương pháp điện di 2 chiều có thể xác định được một số biến đổi có ý nghĩa về mức độ biểu hiện của các glycoprotein trong huyết thanh người bệnh leukemia dạng mãn.
94 Chúng tôi đang tiếp tục nghiên cứu để xác định và làm rõ những biến đổi này bằng các phương pháp khác nhau như Western blot, ELISA…
Một điều đáng chú ý là nhóm Haptoglobin đều có biểu hiện thay đổi trong hai trường hợp bệnh lý đã nghiên cứu là ĐTĐT2 và leukemia, nhưng có sự khác nhau là biểu hiện tăng ở mẫu ĐTĐT2 và giảm ở mẫu leukemia. Có thể nhận thấy nhóm Haptoglobin bao gồm các protein khá nhạy cảm đối với các trạng thái bệnh lý. Để có thể tìm hiểu thêm về vai trò, chức năng của nhóm protein này đối với cơ thể cần có thêm những nghiên cứu tiếp theo.