Mẫu nấm được tách chiết DNA tổng số. Phương pháp tách chiết tiến hành theo Gardes và cộng sự, có cải tiến để phù hợp với điều kiện thí nghiệm.
- Dùng bộ cối chày sứ nghiền mẫu nấm trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn, thêm vào lysis cell solution và chuyển vào ống eppendorf 1,5 ml.
- Bổ sung 8 µl proteinase K rồi đảo đều, ủ mẫu ở 560C qua đêm (đây là nhiệt độ thích hợp cho proteinase K hoạt động). Hỗn hợp lysis cell solution và proteinase K sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.
- Kiểm tra độ đồng nhất của mẫu sau khi ủ, sau đó bổ sung thêm 4,5 µl RNase đề loại bỏ RNA. Đảo đều và ủ mẫu ở 370C trong khoảng 2 – 3 giờ (đây là nhiệt độ hoạt động thích hợp của RNase).
- Sau 3 giờ tiến hành lấy mẫu ra khỏi bể ổn nhiệt, bổ sung thêm 450 µl muối CH3COONH4, tủa mẫu trong lạnh khoảng 3 giờ. Protein sẽ bị loại bỏ khỏi dung dịch dưới dạng tủa.
- Ly tâm 13000 vòng trong 15 phút, bỏ tủa và hút dung dịch phía trên sang ống eppendorf mới.
- Bổ sung 450 µl phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1), dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein nhưng không hòa tan DNA. Đảo đều và ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút. Khi đó hỗn hợp dịch phân thành 3 pha: pha trên cùng là DNA, pha giữa là protein và pha dưới là phenol: chloroform : isoamyl alcohol. Pha dịch DNA sẽ được thu bằng cách hút và chuyển dịch sang ống eppendorf mới.
- Bổ sung 450 µl chloroform : isoamyl alcohol và tiến hành các bước giống như bổ sung hỗn hợp (25:24:1) ở trên.
- Dịch DNA thu được cho vào eppendorf chứa 850 µl cồn 100% và 40 µl CH3COONa, đảo đều và để tủa trong ngăn đá qua đêm (-200
C). - Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút, thu tủa DNA.
- DNA được rửa trong 400µl cồn 70% để loại bỏ các muối và chloroform isoamyl alcohol.
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- DNA sau khi thu được làm khô bằng máy Speed Vac từ 5 - 7 phút. - Bảo quản DNA trong 50µl TE và giữ ở nhiệt độ -200