Mẫu sau khi thu thập được phân lập, thuần khiết, tuyển chọn theo khả năng tạo và phát triển thể quả. Chủng A9 có khả năng sinh thể quả trong thời gian ngắn nhất và có số lượng thể quả nhiều nhất, do đó được chọn để tách chiết DNA và xác định tên khoa học bằng giải trình tự ITS.
DNA tổng số của mẫu nấm được tách chiết và làm sạch theo phương pháp dùng lysis. Sản phẩm được điện di kiểm tra, đánh giá trên gel agaroza 1% và hình 3.12 là kết quả thu được.
Hình 3.12. Ảnh điện di DNA của chủng A9
M: Marker λ DNA /EcoRI + HindIII 1: DNA của chủng A9
Kết quả hình 3.12 cho thấy, sản phẩm điện di thu được vạch gọn, không bị đứt gãy, có kích thước khoảng 21,26 kb. Tỉ lệ OD260 nm/OD280 nm (không dẫn bảng) của mẫu 1 tương ứng là 1,98 cho thấy DNA tách chiết đảm bảo chất lượng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Sản phẩm DNA của chủng A9 sau tinh sạch được dùng làm khuôn để nhân đoạn gen ITS với cặp mồi ITS1 và ITS2. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như mô tả ở phần phương pháp nghiên cứu. Kết quả thu được 1 băng có kích thước khoảng 560bp, phù hợp với tính toán theo lý thuyết (hình 3.13).
Hình 3.13. Ảnh điện di sản phẩm PCR
1: Sản phẩm PCR của chủng A9
M: Maker của Fermentas
Sản phẩm PCR được tinh sạch và được xác định trình tự trên máy tự động ABI PRISM 3100 – Avant Data Collection v1.0. Kết quả được trình bày trên hình 3.14.
Hình 3.14 cho thấy, đoạn gen của chủng A9 có kích thước 591bp. Kết quả được phân tích bằng phần mềm Clustalx (1.81), sau đó được so sánh với các trình tự trên ngân hàng gen bằng chương trình Blast, theo đó với mức tương đồng 99% có 5 trình tự Cordyceps takaomontana, 34 trình tự Isaria tenuipes, 9 trình tự Paecilomyces tenuipes và 2 trình tự Isaria japonica. Nhiều nghiên cứu và phân tích trình tự DNA đã khẳng định Isaria tenuipes, Paecilomyces tenuipes,
Isaria japonica đều là thể vô tính của Cordyceps takaomontana. Do đó, có thể kết
luận chủng A9 là Cordyceps takaomontana.
Hình 3.15. Sơ đồ cây phân loại chủng C.takaomontana A9