Môi trường lỏng là môi trường nhân giống cấp II, có vai trò trong hoạt hóa giống, tăng khả năng sinh bào tử của chủng giống. Sau khi đã chọn lựa được môi trường nhân giống cấp I chủng A9, tiến hành hoạt hóa giống trên môi trường lỏng. Sợi nấm từ môi trường thạch được đưa sang môi trường lỏng với tỷ lệ theo thể tích dịch nuôi/ thể tích bình là 1:5 (v/v), tốc độ lắc 150 vòng/phút tại 250C. Tiến hành kiểm tra số lượng bào tử của các công thức sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày, 11 ngày nuôi. Dựa vào các số liệu thu được, có thể xác định thời
gian nuôi lỏng giống cấp II, khi nồng độ bào tử đạt yêu cầu để chuyển sang môi trường rắn. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.2, hình 3.18 và 3.19.
Bảng 3.2.Khả năng sinh bào tử của chủng A9 trên các môi trường hoạt hóa lỏng
Mật độ bào tử theo ngày (bào tử/ml) Môi trƣờng Ngày nuôi thứ 3 Ngày nuôi thứ 5 Ngày nuôi thứ 7 Ngày nuôi thứ 9 Ngày nuôi thứ 11 HHL1 3,70±0,3x103 6,30±0,3x104 5x106 6,70±0,3x108 4x1010 HHL2 1,70±0,3x103 4,70±0,3x104 4x106 5 x 107 3,30±0,6x108 HHL3 102 3±0,5x103 4,30±0,3x104 4±0,5x105 2,70±0,3x106
Số liệu xử lý trên Anova one – way có P < 0,05, nên các giá trị thu được có ý nghĩa thống kê.
Kết quả của bảng 3.2, hình 3.18 và 3.19 cho thấy, vào ngày thứ 3, mật độ bào tử trên môi trường hoạt hóa lỏng HHL3 là ít nhất, chỉ đạt 102 bào tử/ml. Trong khi đó, mật độ bào tử trên môi trường HHL1 là 3,70 x 103 bào tử/ml và trên môi trường HHL2 là 1,70 x 103
bào tử/ml. Đến ngày nuôi thứ 5, mật độ bào tử trên môi trường HHL1 đạt giá trị là 6,30 x 104 bào tử/ ml, theo sau là môi trường HHL2 với mật độ bào tử đạt 4,70 x 104
bào tử/ ml, và môi trường HHL3 với 3 x 103 bào tử/ml. Tại ngày nuôi thứ 7, mật độ bào tử trên môi trường HHL3 vẫn đạt giá trị nhỏ nhất là 4,30 x 104 bào tử/ ml, đạt giá trị lớn nhất trên môi trường HHL1 là 5 x 106
bào tử/ ml. Tại thời điểm ngày nuôi thứ 5 và thứ 7, mật độ bào tử chủng C.takaomontana A9 của môi trường HHL1 và HHL2 có giá trị gần tương đương nhau, tương ứng với 104 bào tử/ ml và 106 bào tử/ ml. Giá trị này của môi trường HHL1 và HHL2 gấp 10 và 100 lần so với môi trường HHL3 (tương ứng là 103 bào tử/ ml và 104 bào tử/ ml). Đến ngày nuôi thứ 9, mật độ bào tử trên môi trường HHL1 đạt 6,70 x 108 bào tử/ ml, trong khi môi trường HHL2 đạt 5 x 107
và môi trường HHL3 đạt 4 x 105 bào tử. Tại ngày thứ 11 tính từ thời điểm nuôi, mật độ bào tử vẫn đạt giá trị lớn nhất trên môi trường HHL1 là 4x 1010 bào tử/ ml, đạt giá trị nhỏ nhất trên môi trường HHL3 là 2,70 x 106 bào tử/ ml. Bảng thành phần của các môi trường nghiên cứu (bảng 2.3) cho biết, thành phần môi trường của HHL3 có hàm lượng đường 60g/l và muối
khoáng MgSO4 50g/l. Vì nồng độ đường và nồng độ muối khoáng cao, gây ức chế khả năng sinh bào tử của chủng nấm, do vậy nồng độ bào tử của môi trường HHL3 thấp nhất so với hai môi trường còn lại. Hai môi trường HHL1 và HHL2 với nồng độ các chất trong môi trường gần giồng như nhau, nhưng môi trường HHL1 giàu nguồn N hữu cơ (pepton, cao nấm men) hơn so với môi trường HHL2 chính vì lý do này nên nồng độ bào tử của môi trường HHL1 cao hơn so với môi trường HHL2. Như vậy, tỷ lệ thành phần các chất trong môi trường hoạt hóa lỏng HHL1 là thích hợp cho quá trình phát triển sinh bào tử của
Cordyceps takaomontana nên được lựa chọn để hoạt hóa giống cho chủng
C.takaomontana A9.
Hình 3.18. Hình ảnh bào tử của chủng C.takaomontana A9 dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 400 lần)
Hình 3.19. Hình ảnh bào tử của chủng C.takaomontana A9 dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 400 lần)