Sắc ký lỏng cao áp (High-performance liquid chromatography) là kỹ thuật sắc ký sử dụng để phân tách một hỗn hợp trong lĩnh vực hóa phân tích (analytical chemistry) và sinh hóa (biochemistry) với mục đích xác định, định lượng và tinh khiết từng thành phân riêng lẻ của hợp chất. Sự phân tách HPLC ảnh hưởng bởi điều kiện của các dung môi lỏng (áp suất và nhiệt độ), sự tương tác hóa học giữa hỗn hợp mẫu với dung môi lỏng và tương tác hóa học giữa các hợp chất mẫu và nguyên tử đặc rắn bên trong cột phân tích (như ái lực ligand, trao đổi ion,…).
Pha động sử dụng hệ dung môi: MeOH/H2O với gradient được thiết lập trình bày trong bảng 2.6.
Bảng 2.6. Gradient nồng độ thiết lập
Thời gian (phút) 0 5 12 15 17 29 30 40
% MeOH 8 8 50 50 90 50 100 100
% H2O 92 92 50 50 10 10 0 0
- Lượng mẫu bơm:1µl, tốc độ dòng: 0,5 ml/phút - Áp suất đầu phun: 60 psi, nhiệt độ làm khô: 2500C
- Các mẫu thô được cân chính xác, chiết 3 lần trong MeOH với thể tích xác định, dịch chiết được gom, định mức và lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi bơm vào hệ thống LC/MS.
- Định lượng Adenosine: Kiểm tra trên hệ thống LC, bước sóng lựa chọn: 260nm. Trên hệ thống LC, pic tín hiệu được lựa chọn của Adenosine được phát hiện một cách ổn định tại thời gian lưu Rt 13,5 - 13,6 phút đối với các mẫu chất chỉ thị dùng trong thang định lượng, đồng thời hệ thống MS phát hiện được pic ion phân tử của Adenosine tại thời điểm 13,6 - 13,7 phút với pic ion phân tử 268 [M+H]+.
- Định lượng Beauvericine: Định lượng bằng khối phổ, chế độ quét ion mảnh tại m/z 806 [M+H]+ của Beauvericine, chế độ quét ion tổng được thiết lập chạy đồng thời để phân tích, đối chiếu với ion tổng của các mẫu phân tích. Trên
sắc ký đồ, pic ion phân tử của Beauvericine xuất hiện ổn định với cường độ cao nhất tại thời gian lưu 27,1 - 27,3 phút.