Số liệu thống kê được xử lý bằng ứng dụng Excel trong Microsoft Office 2010.
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu thập, phân lập và tuyển chọn chủng nấm
Tiến hành thu thập các mẫu trong lớp lá cây mục tại rừng Quốc gia Hoàng Liên, Lào Cai. Các mẫu thu được ký hiệu là VN3, VN4, VN6, VN7, VN8, VN9 và được trình bày ở các hình 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6.
Hình 3.1. Mẫu VN3 Hình 3.2. Mẫu VN4
Hình 3.3. Mẫu VN6 Hình 3.4. Mẫu VN7
Hình 3.5. Mẫu VN8 Hình 3.6. Mẫu VN9
Thể quả của mẫu Cordyceps spp. thu thập được đều mọc trên nhộng của côn trùng họ cánh vảy, với thể quả đa phần phân nhánh, ở phần đỉnh thể quả có
lớp phần trắng mịn bao phủ phía trên. Vật chủ của quả thể có lớp bông xốp trắng, hoặc hơi vàng.
Mẫu VN3, quả thể thu thập được trên vật chủ có dạng thân khá mảnh, vàng nhạt, đỉnh các quả thể chia làm nhiều nhánh nhỏ, bao phủ xung quanh là các hạt phân mịn màu trắng, dễ dàng tách khỏi quả thể. Bên cạnh đó, mẫu VN4 có đặc điểm tương tự so với VN3, nhưng quả thể to, số lượng nhánh ở phía đầu và quả thể ít hơn. Mật độ hệ sợi bao phủ xung quanh vật chủ mẫu VN4 thưa. Chiều cao quả thể ở mẫu VN3 khoảng 3 - 4 cm, VN4 từ 6 - 7 cm. Trong khi đó, mẫu thu thập VN6 có các nhánh nhỏ bắt đầu xuất hiện ở 1/3 chiều dài quả thể, tạo hình dáng hơi to và rộng ở phía trên, chiều cao quả thể đạt tới 10 cm, mật độ phấn mịn và bao xung quanh các nhánh nhỏ trên đầu thể quả thấp. Mẫu VN7, với chiều cao 4 - 7cm, số lượng nhánh nhỏ mọc tập trung nhiều từ 1/3 đến 1/2 chiều dài thể quả, lượng phấn trắng bao phủ dày, tạo nên tán rộng cho phần đỉnh quả thể. Quả thể của mẫu VN7 mập hơn rất nhiều so với VN3, VN4 và VN6. Thân quả thể của mẫu VN8 có màu vàng hơi đậm hơn so những mẫu còn lại, mật độ thể quả mọc nhiều 13 thể quả/vật chủ (trong khi VN7 có 8 quả thể và các mẫu còn lại có số lượng quả thể ít hơn). Tỷ lệ lượng phấn trắng phủ ít, 2/3 chiều dài thể quả phía trên to hơn phần thân và cuống. Thể quả thấp từ 2 - 5 cm nhưng có thân dày. Nổi bật nhất là mẫu VN9, với mẫu quả thể thu thập được có chiều cao vượt trội hơn 5 mẫu thu thập còn lại (khoảng 10 - 12 cm), thân mảnh, phần đỉnh chia thành nhiều nhánh nhỏ kích thước tương đối đồng đều, mật độ phấn trắng mịn bao phủ nhiều, xung quang phần đỉnh thể quả giống như những bông hoa tuyết nhỏ.
Tiến hành phân lập 6 mẫu Cordyceps spp. theo phương pháp của Samson và cộng sự (1988), các mẫu được cắt thành miếng và nuôi từ 5 – 7 ngày ở 250C trên môi trường PDA. Các mẫu nấm thu được sau khi cấy ria, xuất hiện các bào tử đơn riêng rẽ, cấy chuyển sang môi trường PDA mới và tiếp tục nuôi ở 250C trong điều kiện không chiếu sáng. Kết quả được thể hiện ở các hình 3.7, 3.8, 3.9, 3.10, 3.11.
Hình 3.7. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A3
Hình 3.8. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A6
Hình 3.9. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A7
Hình 3.11. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A9
Kết quả phân lập được 5 chủng ký hiệu lần lượt là A3, A6, A7, A8, A9 tương ứng với các mẫu VN3, VN6, VN7, VN8, VN9. Các chủng sau khi phân lập có đặc điểm chung là dạng bông xốp mịn, nổi lên trên bề mặt thạch và mọc tỏa tròn.
Từ các hình 3.7, 3.8, 3.9, 3.10, 3.11 cho thấy màu sắc hệ sợi đa phần là tương tự nhau nhưng khác nhau rõ rệt nhất là mật độ hệ sợi của chủng phân lập được. Về sắc tố hệ sợi, A3, A6, A7, A9 có màu trắng tinh, chủng A8 thì cho màu sắc trắng ngà.
Các hình đều quan sát thấy các khuẩn lạc đồng nhất, đĩa ria có các khuẩn lạc riêng rẽ, thể hiện các chủng phân lập được là chủng thuần khiết.
3.2. Đánh giá khả năng tạo thể quả của các chủng nấm phân lập
Tiến hành hoạt hóa các chủng thuần khiết trong môi trường lỏng tại 250C với tốc độ lắc 150 vòng/phút. Sau 7 ngày, chuyển các chủng đã hoạt hóa sang lên men bề mặt trên môi trường gạo lứt (40g) + bột nhộng (5g), có bổ sung nguồn dinh dưỡng và nuôi ở 250C có chiếu sáng với cường độ 150 - 200 lux, quan sát và đánh giá khả năng mọc quả thể của các chủng tại ngày nuôi thứ 45. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Khả năng tạo thể quả của các chủng nấm đã phân lập
Chủng nấm Chỉ tiêu đánh giá
A9 A8 A7 A6 A3
Tạo thể quả + - + + -
Thời gian tạo thể quả (ngày) 21 0 28 24 0
Số lượng quả thể tạo ra 41 0 26 31 0
Kết quả bảng 3.1 cho thấy, trong 4 chủng nhân nuôi, có 2 chủng không tạo được thể quả là chủng A8 và chủng A3, 3 chủng cho thể quả là chủng A9, chủng A7, chủng A6 tuy nhiên thời gian mọc và số lượng quả thể khác nhau. Chủng A9 có thể quả sớm nhất tại ngày thứ 21, trong khi đó chủng A6 xuất hiện thể quả tại ngày thứ 24 và muộn nhất là chủng A7 với thời gian nảy mầm tạo thể quả là 28 ngày. Ngoài ra, số lượng thể quả tạo ra ở các chủng cũng không giống nhau, cao nhất là chủng A9 với 41 thể quả/lọ, tiếp theo là chủng A6 với 31 thể quả/lọ và thấp nhất là chủng A7 với 26 thể quả/lọ. Từ kết quả nghiên cứu trên, thấy rằng chủng A9 có số lượng thể quả nhiều nhất trong thời gian ngắn nhất so với 2 chủng còn lại. Chính vì vậy, chủng A9 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3. Xác định tên khoa học của chủng nấm phân lập bằng trình tự ITS
Mẫu sau khi thu thập được phân lập, thuần khiết, tuyển chọn theo khả năng tạo và phát triển thể quả. Chủng A9 có khả năng sinh thể quả trong thời gian ngắn nhất và có số lượng thể quả nhiều nhất, do đó được chọn để tách chiết DNA và xác định tên khoa học bằng giải trình tự ITS.
DNA tổng số của mẫu nấm được tách chiết và làm sạch theo phương pháp dùng lysis. Sản phẩm được điện di kiểm tra, đánh giá trên gel agaroza 1% và hình 3.12 là kết quả thu được.
Hình 3.12. Ảnh điện di DNA của chủng A9
M: Marker λ DNA /EcoRI + HindIII 1: DNA của chủng A9
Kết quả hình 3.12 cho thấy, sản phẩm điện di thu được vạch gọn, không bị đứt gãy, có kích thước khoảng 21,26 kb. Tỉ lệ OD260 nm/OD280 nm (không dẫn bảng) của mẫu 1 tương ứng là 1,98 cho thấy DNA tách chiết đảm bảo chất lượng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Sản phẩm DNA của chủng A9 sau tinh sạch được dùng làm khuôn để nhân đoạn gen ITS với cặp mồi ITS1 và ITS2. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như mô tả ở phần phương pháp nghiên cứu. Kết quả thu được 1 băng có kích thước khoảng 560bp, phù hợp với tính toán theo lý thuyết (hình 3.13).
Hình 3.13. Ảnh điện di sản phẩm PCR
1: Sản phẩm PCR của chủng A9
M: Maker của Fermentas
Sản phẩm PCR được tinh sạch và được xác định trình tự trên máy tự động ABI PRISM 3100 – Avant Data Collection v1.0. Kết quả được trình bày trên hình 3.14.
Hình 3.14 cho thấy, đoạn gen của chủng A9 có kích thước 591bp. Kết quả được phân tích bằng phần mềm Clustalx (1.81), sau đó được so sánh với các trình tự trên ngân hàng gen bằng chương trình Blast, theo đó với mức tương đồng 99% có 5 trình tự Cordyceps takaomontana, 34 trình tự Isaria tenuipes, 9 trình tự Paecilomyces tenuipes và 2 trình tự Isaria japonica. Nhiều nghiên cứu và phân tích trình tự DNA đã khẳng định Isaria tenuipes, Paecilomyces tenuipes,
Isaria japonica đều là thể vô tính của Cordyceps takaomontana. Do đó, có thể kết
luận chủng A9 là Cordyceps takaomontana.
Hình 3.15. Sơ đồ cây phân loại chủng C.takaomontana A9
3.4. Lựa chọn môi trƣờng thạch thích hợp cho nhân giống
Chủng C.takaomontana A9 được nuôi trên các môi trường thạch khác nhau, trong điều kiện 250
C và không chiếu sáng, để chọn môi trường thích hợp cho nhân giống cấp 1. Ba môi trường sử dụng cho nhân giống cấp I gồm: PDA (khoai tây, thạch, glucose), SMAY (maltose, thạch, cao nấm men), SDAY (glucose, thạch, cao nấm men). Tiến hành đánh giá tốc độ tăng trưởng đường kính khuẩn lạc chủng A9 theo thời gian. Kết quả được thể hiện trong hình 3.16.
Hình 3.16. Biểu đồ tốc độ tăng trưởng đường kính khuẩn lạc của chủng C.takaomontana A9
Tốc độ phát triển khuẩn lạc của chủng C.takaomontana A9 trên 3 môi trường PDA, SDAY, SMAY có sự khác nhau theo ngày nuôi. Sau 3 ngày tính từ thời điểm nuôi, kích thước khuẩn lạc của chủng C.takaomontana A9 có giá trị lớn nhất khi nuôi trên môi trường SDAY đạt 1,51 cm và nhỏ nhất trên môi trường PDA đạt 1,15 cm. Tại ngày nuôi thứ 5, kích thước khuẩn lạc chủng A9 đạt 2,33 cm trên môi trường PDA trong khi trên môi trường SMAY và SDAY đạt lần lượt là 2,70 cm và 2,80 cm. Kích thước khuẩn lạc tiếp tục tăng, đạt 3,75 cm trên môi trường SDAY tại ngày nuôi thứ 7, theo sau là môi trường SMAY đạt 3,45 cm và môi trường PDA đạt 3 cm. Sau 9 ngày tính từ thời điểm nuôi, kích thước khuẩn lạc chủng nấm C.takaomontana A9 vẫn đạt giá trị nhỏ nhất trên môi trường PDA là 3,70 cm và lớn nhất trên môi trường SDAY là 4,69 cm. Tại ngày nuôi thứ 11, 13, 15, kích thước khuẩn lạc đạt giá trị tương ứng trên môi trường PDA là 4,51 cm, 5,24 cm và 6 cm, trên môi trường SMAY là 5,38 cm, 6,21 cm và 7,03 cm, trên môi trường SDAY lần lượt là 5,67 cm, 6,82 cm và 7,69 cm. Tiếp tục theo dõi tốc độ phát triển của khuẩn lạc, nhận tại ngày nuôi thứ 17, môi trường SDAY vẫn cho giá trị về kích thước khuẩn lạc và lớn nhất đạt 8,16 cm, tiếp theo là môi trường SMAY đạt 7,80 cm và môi trường PDA đạt 6,89 cm. Nhận thấy, từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 17 tính từ thời điểm nuôi, khuẩn lạc chủng C.takaomontana A9 liên tục tăng trưởng về kích thước, đạt giá trị lớn nhất trên môi trường SDAY và nhỏ nhất trên môi trường PDA. Mặc dù vậy, khuẩn lạc vẫn chưa phủ kín đĩa thạch trên 3 môi
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25
Môi trường PDA Môi trường SMAY Môi trường SDAY
trường nghiên cứu. Tuy nhiên, vào ngày nuôi thứ 19, khuẩn lạc chủng A9 đã phủ kín đĩa thạch môi trường SDAY với kích thước 8,50 cm, trong khi đó thời gian để khuẩn lạc phủ kín đĩa thạch SMAY và PDA lần lượt là 21 ngày và 25 ngày.
Hình 3.17. Hình ảnh khuẩn lạc chủng A9 trên các môi trường
1: Môi trường PDA; 2: Môi trường SMAY; 3: Môi trường SDAY
Kết quả hình 3.17 cho thấy, khuẩn lạc trên cả 3 môi trường có dạng bông xốp, mịn, hệ sợi mọc dày nhất trên môi trường SDAY, theo sau là môi trường SMAY và thưa nhất trên môi trường PDA. Điều này được giải thích là do trong thành phần của môi trường SMAY và SDAY được bổ sung nguồn cung cấp nitơ là cao nấm men, và cũng chính nguồn cung cấp nitơ này giúp khuẩn lạc phát triển nhanh hơn so với môi trường PDA. Bên cạnh đó, khi thay đổi nguồn cacbon và giữ nguyên nguồn nitơ hữu cơ, nhận thấy chủng A9 có mật độ hệ sợi trên môi trường đường đơn chức – môi trường SDAY mọc dày hơn trên môi trường đường đa chức – môi trường SMAY. Do vậy, môi trường SDAY được lựa chọn để nhân giống cấp I cho chủng C.takaomontana A9.
3.5. Lựa chọn môi trƣờng lỏng thích hợp cho nhân giống
Môi trường lỏng là môi trường nhân giống cấp II, có vai trò trong hoạt hóa giống, tăng khả năng sinh bào tử của chủng giống. Sau khi đã chọn lựa được môi trường nhân giống cấp I chủng A9, tiến hành hoạt hóa giống trên môi trường lỏng. Sợi nấm từ môi trường thạch được đưa sang môi trường lỏng với tỷ lệ theo thể tích dịch nuôi/ thể tích bình là 1:5 (v/v), tốc độ lắc 150 vòng/phút tại 250C. Tiến hành kiểm tra số lượng bào tử của các công thức sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày, 11 ngày nuôi. Dựa vào các số liệu thu được, có thể xác định thời
gian nuôi lỏng giống cấp II, khi nồng độ bào tử đạt yêu cầu để chuyển sang môi trường rắn. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.2, hình 3.18 và 3.19.
Bảng 3.2.Khả năng sinh bào tử của chủng A9 trên các môi trường hoạt hóa lỏng
Mật độ bào tử theo ngày (bào tử/ml) Môi trƣờng Ngày nuôi thứ 3 Ngày nuôi thứ 5 Ngày nuôi thứ 7 Ngày nuôi thứ 9 Ngày nuôi thứ 11 HHL1 3,70±0,3x103 6,30±0,3x104 5x106 6,70±0,3x108 4x1010 HHL2 1,70±0,3x103 4,70±0,3x104 4x106 5 x 107 3,30±0,6x108 HHL3 102 3±0,5x103 4,30±0,3x104 4±0,5x105 2,70±0,3x106
Số liệu xử lý trên Anova one – way có P < 0,05, nên các giá trị thu được có ý nghĩa thống kê.
Kết quả của bảng 3.2, hình 3.18 và 3.19 cho thấy, vào ngày thứ 3, mật độ bào tử trên môi trường hoạt hóa lỏng HHL3 là ít nhất, chỉ đạt 102 bào tử/ml. Trong khi đó, mật độ bào tử trên môi trường HHL1 là 3,70 x 103 bào tử/ml và trên môi trường HHL2 là 1,70 x 103
bào tử/ml. Đến ngày nuôi thứ 5, mật độ bào tử trên môi trường HHL1 đạt giá trị là 6,30 x 104 bào tử/ ml, theo sau là môi trường HHL2 với mật độ bào tử đạt 4,70 x 104
bào tử/ ml, và môi trường HHL3 với 3 x 103 bào tử/ml. Tại ngày nuôi thứ 7, mật độ bào tử trên môi trường HHL3 vẫn đạt giá trị nhỏ nhất là 4,30 x 104 bào tử/ ml, đạt giá trị lớn nhất trên môi trường HHL1 là 5 x 106
bào tử/ ml. Tại thời điểm ngày nuôi thứ 5 và thứ 7, mật độ bào tử chủng C.takaomontana A9 của môi trường HHL1 và HHL2 có giá trị gần tương đương nhau, tương ứng với 104 bào tử/ ml và 106 bào tử/ ml. Giá trị này của môi trường HHL1 và HHL2 gấp 10 và 100 lần so với môi trường HHL3 (tương ứng là 103 bào tử/ ml và 104 bào tử/ ml). Đến ngày nuôi thứ 9, mật độ bào tử trên môi trường HHL1 đạt 6,70 x 108 bào tử/ ml, trong khi môi trường HHL2 đạt 5 x 107
và môi trường HHL3 đạt 4 x 105 bào tử. Tại ngày thứ 11 tính từ thời điểm nuôi, mật độ bào tử vẫn đạt giá trị lớn nhất trên môi trường HHL1 là 4x 1010 bào tử/ ml, đạt giá trị nhỏ nhất trên môi trường HHL3 là 2,70 x 106 bào tử/ ml. Bảng thành phần của các môi trường nghiên cứu (bảng 2.3) cho biết, thành phần môi trường của HHL3 có hàm lượng đường 60g/l và muối
khoáng MgSO4 50g/l. Vì nồng độ đường và nồng độ muối khoáng cao, gây ức chế khả năng sinh bào tử của chủng nấm, do vậy nồng độ bào tử của môi trường HHL3 thấp nhất so với hai môi trường còn lại. Hai môi trường HHL1 và HHL2 với nồng độ các chất trong môi trường gần giồng như nhau, nhưng môi trường HHL1 giàu nguồn N hữu cơ (pepton, cao nấm men) hơn so với môi trường HHL2 chính vì lý do này nên nồng độ bào tử của môi trường HHL1 cao hơn so với môi trường HHL2. Như vậy, tỷ lệ thành phần các chất trong môi trường hoạt hóa lỏng HHL1 là thích hợp cho quá trình phát triển sinh bào tử của
Cordyceps takaomontana nên được lựa chọn để hoạt hóa giống cho chủng
C.takaomontana A9.
Hình 3.18. Hình ảnh bào tử của chủng C.takaomontana A9 dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 400 lần)
Hình 3.19. Hình ảnh bào tử của chủng C.takaomontana A9 dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 400 lần)
3.6. Nghiên cứu nhân nuôi sinh khối tạo hoạt chất sinh học