Các thiết bị được sử dụng thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Bao gồm: Tủ lạnh 20C (Sanyo, Nhật Bản), Cân phân tích (Mettler Toledo, Thụy Sỹ), bể ổn nhiệt (Memmert, Đức), máy làm khô chân không (Concentrator Plus) (Eppendorf, Đức), máy li tâm lạnh Eppendorf 5424R (Eppendorf, Đức), máy li tâm lạnh đa năng 5810R (Eppendorf, Đức), máy chạy điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy PCR Master Cycler Pro S (Eppendorf, Đức), máy soi gel M-26 UVP (Mỹ), máy chụp ảnh gel (GelDoc) UVP (Mỹ), máy ủ nhiệt Thermomixer C (Eppendorf, Đức), máy giải trình tự ABI 3500 Genetic Analyzer (Life Technologies, Nhật), máy biến nạp xung điện Gene Pulser (Bio-Rad, Mỹ), box cấy vi sinh vật The Esco Airstream® Class II Biological Safety Cabinet (Esco, Singapore). Phòng nuôi cấy mô vô trùng, box cấy thực vật Esco laminar flow cabinets (Esco, Singapore).
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết DNA
DNA tổng số của lá ngô được tách chiết theo quy trình của Rogers và Bendich [25]. 0,5 g lá tươi được nghiền thành bột mịn trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Sau đó, bột lá được chuyển vào ống ly tâm 1,5 mL chứa 0,5 mL đệm chiết (100 mM Tris-HCl pH8,0, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA pH8,0, 2% CTAB, 0,2% β- mercaptoethanol) và đảo đều. Hỗn hợp dịch chiết được ủ ở 65°C trong 60 phút. Tiếp theo, ống mẫu được ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và dịch ở pha trên chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL mới. Dung dịch phenol : choloroform : isoamyl alcohol (tỉ lệ thể tích 25 : 24 : 1) được bổ sung vào ống mẫu với tỷ lệ thể tích là 1:1, sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4°C. Dịch ở pha trên được chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL mới. Ống mẫu được xử lý loại bỏ RNA ở 37°C trong 1 giờ bằng cách bổ sung RNase 0,01 mg/mL. DNA được tủa bằng cách bổ sung hai lần thể tích EtOH 100% có bổ sung 0,3M CH3COONa, trộn đều và giữ trong 3 giờ ở -20°C. Sau đó, ống mẫu được ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và loại bỏ dịch. Tủa DNA được rửa bằng cách bổ sung một lần thể tích EtOH 70%, lắc nhẹ ống, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và loại bỏ dịch. Bước rửa được thực hiện hai lần. Tủa được làm khô trong máy SpeedVac trong 5 phút và được hòa trong nước không chứa Dnase. DNA được bảo quản ở -20°C.
Plasmid được tách chiết từ 3 mL dịch nuôi khuẩn lạc đơn trong ống nghiệm chứa môi trường lỏng có bổ sung kháng sinh thích hợp, ở nhiệt độ phù hợp (28°C đối với A. tumefaciens và 37°C đối với E. coli ), nuôi qua đêm với tốc độ lắc 200 vòng/phút. Đầu tiên, dịch nuôi khuẩn được ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4°C để thu cặn tế bào. Sau đó, cặn tế bào được hòa tan trong 150 µL dung dịch I (50 mM glucose, 25 mM Tris-base, 10 mM EDTA pH 8,0). Sau khi bổ sung 150 µL dung dịch II (0,2 M NaOH, 1% SDS) và đảo nhẹ 3 – 5 lần, cho 150 µL dung dịch III ( 3M CH3COOK, 11,5% CH3COOH) vào ống mẫu và đặt trên đá trong 5 phút. Ống mẫu được ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C, thu dịch
trên và chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL mới. Ống mẫu được xử lý loại bỏ RNA ở 37°C trong 1 giờ bằng cách bổ sung RNase 0,01 mg/mL. DNA được tủa bằng cách bổ sung hai lần thể tích EtOH 100% có bổ sung 0,3M CH3COONa, trộn đều và giữ trong 3 giờ ở -20°C. Sau đó, ống mẫu được ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và loại bỏ dịch. Tủa DNA được rửa bằng cách bổ sung một lần thể tích EtOH 70%, lắc nhẹ ống, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và loại bỏ dịch. Bước rửa được thực hiện hai lần. Tủa được làm khô trong máy SpeedVac trong 5 phút và được hòa trong nước không chứa Dnase. DNA được bảo quản ở -20°C.
2.2.2. Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA
Trong nghiên cứu này, RNA được tách chiết theo phương pháp sử dụng TRI Reagent có cải tiến phù hợp với mẫu lá ngô. Đầu tiên, 2 - 3 g lá được nghiền thành bột mịn trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Sau đó, bổ sung ngay 700 µL Trizol và bột lá và trộn đều. Hỗn hợp mẫu được chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL và giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Tiếp theo, ống mẫu được ly tâm ở điều kiện 12.000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4°C, sau đó thu dịch ở pha trên và chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL mới. 300 µL Chloroform được bổ sung vào ống và vortex trong 15 – 20 giây. Ống mẫu được ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và dịch trên được chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL mới. RNA được tủa bằng cách bổ sung 300 µL 2-propanol lạnh và ủ mẫu ở -20°C trong 1giờ. Sau đó, ống mẫu được ly tâm với điều kiện 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và loại bỏ dịch. Tủa RNA được rửa bằng cách bổ sung 300 µL EtOH 70%, lắc nhẹ ống và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và loại bỏ dịch. Bước rửa tủa được thực hiện hai lần. Tủa RNA được làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút sau đó hòa tan RNA tổng số trong 50 µL nước đã được xử lý với DEPC (Diethyl pyrocarbonate). RNA tổng số được bảo quản ở -80°C.
RNA được kiểm tra nồng độ bằng máy đo quang phổ và đưa về nồng độ 1 µg/µL để làm khuôn cho phản ứng tổng hợp sợi thứ nhất. Phản ứng tổng hợp cDNA sử dụng bộ kit USB® First-Strand cDNA Synthesis Kit for Real-Time PCR
(Affymetrix, Mỹ). Quy trình thao tác được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.2.3. Phương pháp PCR
Phản ứng PCR được tiến hành với thể tích là 25 µL. Bao gồm các thành phần: 2,5 µL 10X DreamTaq Buffer, 1 µL dNTPs 10mM, 1 µL 10 µM mồi xuôi, 1 µL 10 µM mồi ngược, 1 µL DNA khuôn (20 ng – 100 ng), 0,2 µL 5U/µL DreamTaq DNA polymerase và nước. Phản ứng được thực hiện trên máy luân nhiệt PCR Master Cycler Pro S với chu trình nhiệt như sau:
- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR phân lập trình tự ZmDREB2.7: 95°C - 3 phút; 30 chu kỳ: 95°C - 45 giây, 58°C - 45 giây, 72°C - 1 phút 30 giây; 72°C - 5 phút; 4°C.
- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân vùng mã hóa gen ZmDREB2.7tv: 95°C - 3 phút; 30 chu kỳ: 95°C - 30 giây, 54°C - 30 giây, 72°C - 1 phút; 72°C - 5 phút; 4°C.
- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân vùng rd29A::ZmDREB2.7tv: 95°C - 3 phút; 30 chu kỳ: 95°C - 30 giây, 56°C - 30 giây, 72°C - 1 phút 15 giây; 72°C - 5 phút; 4°C.
- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân gen HygR: 95°C - 3 phút; 30 chu kỳ: 95°C - 30 giây, 54°C - 30 giây, 72°C - 50 giây; 72°C - 5 phút; 4°C.
2.2.4. Tinh sạch DNA
- Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt với enzyme giới hạn được tinh sạch bằng bộ kit GeneJET Gel Purification Kit (Thermo Scientific,Mỹ).
2.2.5. Tạo tế bào khả biến E. coli và biến nạp bằng sốc nhiệt
Tế bào khả biến E. coli được chuẩn bị bằng CaCl2 0,1 M và sau đó được dùng cho biến nạp theo phương pháp sốc nhiệt theo quy trình của của Sambrook và cộng sự [27].
2.2.6. Tạo tế bào khả biến A. tumefaciens và biến nạp bằng xung điện
Tế bào khả biến A. tumefaciens được chuẩn bị bằng HEPES (N-2- hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) 1 mM pH 7,0 để dùng cho biến nạp theo phương pháp xung điện. Đầu tiên, một khuẩn lạc đơn A. tumefaciens được nuôi cấy trong 2 mL môi trường YEP ở 28°C, 6 giờ. Sau đó, 50 µL dịch vi khuẩn trên nuôi cấy tiếp ở 28°C qua đêm trên 50 mL môi trường YEP lỏng đến khi OD660nm đạt 1-1,5. Tiếp theo, dịch vi khuẩn được làm lạnh mẫu trên đá 15 phút rồi ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút để thu cặn tế bào. Tế bào được hòa tan trong 10 mL 1 mM HEPES lạnh và ủ trên đá 15 phút; sau đó ly tâm ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút và bỏ dịch. Bước này được thực hiện hai lần. Sau đó, bổ sung 10 mL 10% glycerol vào ống tế bào, hòa tan tủa và ủ trên đá 15 phút; sau đó ly tâm ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút và bỏ dịch. Tủa tế bào được hòa trong 500-700 µL 10% glycerol và chia 45 µL dịch tế bào vào mỗi ống ly tâm 1,5 mL. Các ống tế bào khả biến được làm lạnh nhanh trong nitơ lỏng và giữ tế bào ở -80°C.
Để biến nạp plasmid vào tế bào khả biến A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện, trước tiên tế bào khả biến A. tumefaciens được làm tan bằng cách đặt ống tế bào trên đá 15 phút. 2 µL plasmid tái tổ hợp được bổ sung vào ống chứa tế bào khả biến, sau đó trộn đều và đặt ống trên đá trong 5 phút. Hỗn hợp được chuyển sang cuvette đã được làm lạnh từ trước; lau sạch bên ngoài cuvette. Tế bào khả biến được xung điện ở 5ms; hiệu điện thế 2,5 kV; điện trở 400Ω. Sau đó, bổ sung ngay 1 mL môi trường SOC lạnh vào cuvette, đảo đều và chuyển dịch khuẩn sang ống vô trùng, lắc ở 28°C trong 1,5 giờ. Dịch nuôi được cấy trải trên môi trường YEP đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc. Khuẩn lạc mọc sau hai ngày nuôi đĩa vi khuẩn ở 28°C.
2.2.7. Nhân dòng gen ZmDREB2.7tv
DNA tổng số được tách chiết từ lá cây ngô Tẻ vàng 1 theo phương pháp đã mô tả ở mục 2.2.1. Sau đó, phản ứng PCR phân lập gen ZmDREB2.7tv được thực hiện với thành phần và chu trình nhiệt như đã mô tả ở mục 2.2.3; trong đó, khuôn là DNA tổng số của cây ngô Tẻ vàng 1 với cặp mồi ZmDREB2.7_F/R. Tiếp theo, sử
dụng bộ kit CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Scientific, Mỹ) để xử lý đầu bằng sản phẩm PCR trên và ghép nối đoạn gen ZmDREB2.7tv vào vector pJET1.2 theo quy trình của nhà sản xuất. Các plasmid nhân dòng được kiểm tra bằng cách xử lý plasmid với enzyme giới hạn BglII và đọc trình tự hai chiều.
2.2.8. Tạo vector biểu hiện thực vật pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv: :polyA :polyA
Vector chuyển gen pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv::polyA được xây dựng bằng các phản ứng cắt và nối với enzyme phù hợp theo sơ đồ trên hình 2.1. Trước tiên, vùng mã hóa của gen ZmDREB2.7tv được gắn với trình tự nhận biết của enzyme giới hạn SacI ở hai đầu bằng phản ứng PCR với cặp mồi ZmDREB2.7_SacI_F/R và khuôn là vector nhân dòng pJET1.2/ZmDREB2.7tv theo thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như ở mục 2.2.3. Sản phẩm PCR ZmDREB2.7_SacI và vector pRTL2/rd29A cùng được cắt bởi enzyme SacI, sau đó nối với nhau để tạo vector trung gian pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv::polyA. Vector tái tổ hợp được kiểm tra bằng cách xử lý với enzyme giới hạn SacI và phản ứng PCR với cặp mồi ZmDREB2.7_SacI_F và polyA_R. Tiếp theo, vector pRTL2/
rd29A::ZmDREB2.7tv::polyA và pCAMBIA1300 cùng được cắt bởi enzyme
HindIII, sau đó nối với nhau để tạo vector pCAMBIA1300/rd29A: :ZmDREB2.7tv::polyA. Các vector tái tổ hợp được kiểm tra bằng cách xử lý với enzyme giới hạn thích hợp.
Hình 2.1. Phương pháp tạo vector biểu hiện mang gen ZmDREB2.7tv
2.2.9. Chuyển gen vào cây ngô thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Cây ngô chuyển gen được tạo ra bằng cách sử dụng quy trình chuyển gen vào phôi ngô non trung gian qua vi khuẩn A. tumefaciens theo Frame và cộng sự [14].
- Chuẩn bị dịch vi khuẩn: Chuyển một khuẩn lạc A. tumefaciens chứa plasmid quan tâm trên đĩa nuôi cấy vào 3 mL môi trường YEP lỏng có bổ sung kháng sinh thích hợp và lắc 200 vòng/phút ở 28°C qua đêm. Dịch nuôi được làm mới trong 50 mL môi trường YEP lỏng có kháng sinh thích hợp. Khi dịch nuôi đạt OD600 = 1, thu tế bào bằng cách ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút, ở 4°C trong 15 phút. Tế bào vi khuẩn được hòa tan trong môi trường lây nhiễm có bổ sung AS (acetyl syringone). Dịch huyền phù vi khuẩn có chỉ số OD600 = 0,5 được sử dụng để
- Chuẩn bị phôi non: Bắp ngô non được thu từ các cây ngô mẹ sau khi thụ phấn từ 9 - 13 ngày. Bắp ngô được khử trùng bề mặt bằng dung dịch NaOCl 5%. Ngay sau khi thu hái, phôi non được tách trong điều kiện vô trùng và được lây nhiễm với dịch vi khuẩn có bổ sung AS nồng độ 100 µM trong 20 phút.
- Đồng nuôi cấy: Phôi sau khi lây nhiễm với vi khuẩn được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy, đặt trong tối ở nhiệt độ 21°C trong 3 ngày.
- Nuôi phục hồi: Chuyển phôi đã biến nạp từ môi trường đồng nuôi cấy sang môi trường phục hồi, đặt trong tối ở nhiệt độ 28°C trong 7 ngày.
- Chọn lọc mô sẹo: Mô sẹo tạo thành từ phôi non được cấy chuyển từ môi trường phục hồi sang môi trường chọn lọc 1 có bổ sung kháng sinh hygromycin (1,5 mg/l), đặt trong tối ở nhiệt độ 28°C trong 14 ngày. Sau đó, các mô sẹo tiếp tục được chuyển sang môi trường chọn lọc 2 có nồng độ kháng sinh hygromycin (3mg/l), đặt trong tối ở nhiệt độ 28oC trong 14 ngày.
- Tạo chồi: Các mô sẹo phôi hoá tạo thành trên môi trường chọn lọc được cấy chuyển sang môi trường tái sinh 1, không có chất kích thích sinh trưởng, đặt trong tối ở nhiệt độ 25°C trong 7 ngày. Các mô sẹo phôi hoá này tiếp đó được cấy chuyển sang môi trường tái sinh 2 không bổ sung kháng sinh, đặt ngoài sáng ở nhiệt độ 25°C, liên tục chuyển môi trường tái sinh 2 cho đến khi các mô sẹo phôi hoá này tạo thành các chồi.
- Tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh: Chồi tái sinh trong môi trường tái sinh được cấy chuyển sang môi trường tạo cây hoàn chỉnh ở điều kiện sáng 25°C, trong khoảng 10 - 20 ngày.
- Chuyển cây ra đất: Cây tái sinh trên môi trường tái sinh khi có khoảng 2 - 3 lá được chuyển ra trồng trên giá thể trấu hun trong hai tuần, sau đó được chuyển ra trồng trên đất.
2.2.10. Real-time PCR định lượng để ước lượng số bản sao của gen trong cây chuyển gen chuyển gen
Phương pháp định lượng tương đối [29] gồm hai phân tích định lượng tuyệt đối được sử dụng để ước lượng số bản sao của gen quan tâm trong cây chuyển gen. Hai phân tích định lượng tuyệt đối được thực hiện trên đoạn rd29A:ZmDREB2.7tv
và gen đối chứng nội sinh globulin-1 (Glb-1 - là gen đơn bản trong cây ngô).
Phản ứng real-time PCR định lượng sử dụng Luna® Universal qPCR Master Mix (New England Biolabs, Mỹ) trên hệ thống máy LightCycler® 96 System (Roche, Thụy Sĩ). Mỗi phản ứng có thể tích 20 µL gồm các thành phần: 10 µL Luna Universal qPCR Master Mix, 0,5 µL 10 µM mồi xuôi, 0,5 µL 10 µM mồi ngược, 1 µL 10 ng DNA tổng số và nước. Cặp mồi nhân vùng rd29A: :ZmDREB2.7tv là grd29A_F và gZm2.7_R. Cặp mồi nhân gen nội sinh Glb-1 là qGlb1_F và qGlb_R. Chu trình nhiệt cho phản ứng như sau: 95°C - 60 giây; 45 chu kỳ: 95°C - 15 giây, 60°C - 30 giây. Điều kiện để phân tích đường cong nóng chảy được sử dụng chương trình mặc định của hệ thống máy.
Đường chuẩn được xây dựng bằng cách pha loãng DNA tổng số của cây chuyển gen D5.1 về nồng độ 1 ng/µL, 10 ng/µL và 100 ng/µL và sử dụng để làm khuôn cho phản ứng real-time PCR. Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại ba lần. Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm LightCycler® 96 version 1.1 và xây dựng đường chuẩn cho mỗi trình tự rd29A::ZmDREB2.7tv và Glb-1.
Khi đó, số lượng bản sao của gen ZmDREB2.7tv trong cây chuyển gen được suy ra tương đối từ tỷ lệ giữa số lượng phân tử ban đầu của trình tự
rd29A::ZmDREB2.7tv với Glb-1 trong hệ gen cây ngô (Z0/G0) theo công thức: {1}
Trong đó, Z và G lần lượt là ký hiệu gen ZmDREB2.7tv và Glb-1; I và S lần lượt là chu kì bão hòa (Y-intercept) và hệ số góc (slope) của đường chuẩn, Ct là giá
2.2.11. Real-time PCR định lượng để đánh giá sự biểu hiện của gen trong cây chuyển gen chuyển gen
Để đánh giá sự biểu hiện tương đối của gen ZmDREB2.7 trong cây, phương pháp real-time PCR định lượng tương đối được sử dụng với gen actin là gen đối