Một trong những yếu tố quan trọng quyết định sự thành công của thí nghiệm chuyển gen vào thực vật đó là lựa chọn được hệ vector biểu hiện phù hợp. Trong nghiên cứu này, hệ vector pCAMBIA được lựa chọn do có những ưu điểm như: (1) Có số lượng bản sao lớn trong E. coli nên lượng DNA thu được lớn; (2) Vùng replicon pVS1 cho mức độ ổn định cao trong Agrobacterium; (3) Kích thước nhỏ, 7-12 kb tùy thuộc vào từng plasmid; (4) Các điểm cắt enzyme giới hạn cho phép dễ dàng lắp ráp/ chèn gen quan tâm; (5) Chọn lọc vi khuẩn bằng chloramphenicol hoặc kanamycin; (6) Chọn lọc thực vật bằng hygromycin B.
Để tạo vector biểu hiện thực vật pCAMBIA/rd29A::ZmDREB2.7tv, vector pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv và vector trống pCAMBIA1300 đồng thời được xử lý với enzyme cắt giới hạn HindIII. Sản phẩm cắt của vector trung gian được tinh sạch bằng phương pháp thôi gel đoạn cấu trúc biểu hiện có kích thước khoảng 2,2 kb. Vector pCAMBIA1300 mở vòng đồng thời được loại nhóm phosphate ở đầu 5’ để tránh hiện tượng tự đóng vòng trong quá trình ghép nối. Sản phẩm của phản ứng nối giữa cấu trúc biểu hiện mang gen ZmDREB2.7tv và khung vector pCAMBIA1300 được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH10β và cấy trải trên đĩa môi trường LB bổ sung kháng sinh kanamycin 50 mg/mL. Đĩa biến nạp được nuôi ở 37°C qua đêm xuất hiện nhiều khuẩn lạc riêng rẽ.
Tất cả plasmid được tách từ 5 khuẩn lạc chọn ngẫu nhiên trên đĩa biến nạp đều cho băng DNA cao hơn plasmid pCAMBIA1300 trống (Hình 3.8). Như vậy, các plasmid này đều được cho là có mang cấu trúc biểu hiện và do đó được xử lý với enzyme giới hạn để kiểm tra kích thước của đoạn chèn.
Hình 3.8. Điện di đồ plasmid tách từ các khuẩn lạc tái tổ hợp pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv
1 - 5 : Plasmid tách từ sáu khuẩn lạc ngẫu nhiên trên đĩa biến nạp pCAMBIA1300/rd29A: :ZmDREB2.7tv lần lượt là KL1 - KL5; 6: Plasmid pCAMBIA1300 trống (đối chứng).
Ba enzyme gồm: SacI, HindIII và BamHI được lựa chọn để kiểm tra cấu trúc biểu hiện trong vector tái tổ hợp pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv (Hình 3.9A). Dựa vào sơ đồ vector (Hình 3.9B), nếu vector pCAMBIA1300 mang cấu trúc biểu hiện gen quan tâm, khi xử lý với enzyme SacI sẽ thu được 3 đoạn với kích thước xấp xỉ là 0,9 kb, 1,1 kb và 9,1 kb (Hình 3.9A, đường chạy số 3). Trong khi đó, khi sử dụng enzyme HindIII để cắt vector này, chỉ thu được hai đoạn gồm: cấu trúc biểu hiện gen ZmDREB2.7tv - 2,2 kb và khung vector pCAMBIA1300 - 9,0 kb (Hình 3.9A, đường chạy số 2). Kết quả xử lý plasmid từ khuẩn lạc 1 cho thấy, đoạn cấu trúc rd29A::ZmDREB2.7tv::polyA đã được sát nhập vào vector pCAMBIA1300. Ngoài ra, trên vector pCAMBIA1300/rd29A: :ZmDREB2.7tv còn có hai vị trí nhận biết của enzyme BamHI, một vị trí nằm trên đoạn cấu trúc biểu hiện gen, một vị trí nằm trên khung vector. Do đó, sử dụng BamHI có thể kiểm tra được chiều của cấu trúc biểu hiện trong vector pCAMBIA1300 so với chiều của gen chỉ thị HygR. Nếu gen ZmDREB2.7tv cùng chiều với gen HygR, xử lý enzyme
BamHI sẽ cho hai băng với kích thước xấp xỉ 0,4 kb và 10,8 kb. Trong khi đó, sự xuất hiện của hai băng với kích thước lần lượt xấp xỉ 2,0 kb và 9,2 kb chứng tỏ gen
ZmDREB2.7tv có chiều ngược lại so với gen HygR. Sản phẩm xử lý vector tái tổ hợp từ khuẩn lạc số 1 với enzyme BamHI cho hai đoạn DNA kích thước tương ứng trong trường hợp cấu trúc chuyển gen nằm ngược chiều với gen HygR (Hình 3.9A,
đường chạy số 1). Khi đó, gen có chiều từ bờ trái (LB) sang bờ phải (RB), phần đuôi polyA nằm gần bờ phải (RB) của T-DNA hơn so với đoạn promoter (Hình 2.1).
A
B
Hình 3.9. Kết quả tạo plasmid pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv
A. Điện di đồ sản phẩm xử lý plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn. M: GeneRulerTM
1kb DNA Ladder (Thermo Scientific); 1 - 3: Sản phẩm xử lý plasmid từ KL1 với các enzyme giới hạn lần lượt là SacI, HindIII, BamHI.