gen thế hệ T2
Mức độ biểu hiện tương đối của gen ZmDREB2.7 được đánh giá trong các cây chuyển gen thế hệ T2 ở mức độ phiên mã ở hai điều kiện thí nghiệm: bình thường và hạn. Các hạt T2 có nguồn gốc từ cây T1 D5.8 được gieo và các cây con được kiểm tra sự có mặt của gen ZmDREB2.7tv bằng thí nghiệm PCR trước khi tiến hành đánh giá sự biểu hiện của gen quan tâm (Hình 3.16).
Hình 3.16. Điện di đồ sản phẩm kiểm tra sự có mặt của gen quan tâm trong cây chuyển gen ZmDREB2.7tv thế hệ T2
1: Sản phẩm PCR với khuôn là plasmid pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7::polyA; 2: Sản phẩm PCR với khuôn là DNA tổng số của cây không chuyển gen;3-4: Sản phẩm PCR
với khuôn là DNA tổng số của các cây chuyển gen thế hệ T2 của cây T1 D5.8
Như mô tả ở phần phương pháp, cây không chuyển gen và cây chuyển gen
ZmDREB2.7tv dương tính với sự có mặt của gen quan tâm được gây hạn nhân tạo bằng dung dịch PEG6000 20%. Lá của các cây được thu để đánh giá mức độ biểu hiện của gen ZmDREB2.7 trong các cây ngô này ở giai đoạn trước xử lý (0h) và sau xử lý hạn (6h).
Hình 3.17. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện tương đối của gen ZmDREB2.7 của cây chuyển gen khi gặp hạn.
Do cặp mồi thiết kế nằm trong vùng trình tự mã hóa của gen ZmDREB2.7tv, sản phẩm của gen ZmDREB2.7 nội sinh cũng được khuếch đại. Vì vậy, kết quả của phản ứng real-time PCR định lượng thể hiện mức độ biểu hiện tương đối của gen
ZmDREB2.7 nói chung trong cây (Hình 3.17). Trước khi xử lý hạn (điều kiện bình thường), sự biểu hiện của gen ZmDREB2.7 là tương đương giữa cây không chuyển gen và không chuyển gen do gen ZmDREB2.7tv được điều khiển bởi promoter cảm ứng rd29A. Tuy nhiên, sau 6 giờ xử lý hạn, mức độ biểu hiện của gen ZmDREB2.7
tăng lên đáng kể ở tất cả các cây thí nghiệm. Trong đó, hai cây chuyển gen có mức độ biểu hiện của gen ZmDREB2.7 cao hơn so với cây không chuyển gen. Điều này có thể được giải thích là do bên cạnh gen ZmDREB2.7 nội sinh, cây chuyển gen có thêm gen ZmDREB2.7tv và do đó số lượng sản phẩm phiên mã tăng lên. Như vậy, các cây chuyển gen thế hệ T2 có sự biểu hiện của cấu trúc chuyển gen
KẾT LUẬN
1. Đã phân lập và xác định trình tự nucleotide đoạn mang gen DREB2.7 từ giống ngô địa phương chịu hạn Tẻ vàng 1. Gen ZmDREB2.7tv có độ tương đồng 98% so với gen ZmDREB2.7 của cây ngô tham chiếu B73. Protein suy diễn ZmDREB2.7tv có một vài thay đổi trên trình tự amino acid tuy nhiên vùng bám DNA vẫn được bảo toàn.
2. Đã thiết kế vector trung gian và vector chuyển gen thực vật mang đoạn trình tự mã hóa của gen ZmDREB2.7tv, trong đó, đoạn gen ZmDREB2.7tv được điều hòa bởi promoter cảm ứng với hạn rd29A. Đồng thời, đã tạo được chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang vector chuyển gen thực vật pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv::polyA.
3. Đã tạo được cây ngô chuyển gen ZmDREB2.7tv với hiệu suất chuyển gen đạt 0,99%. Cây chuyển gen được kiểm chứng bằng các thí nghiệm sinh học phân tử để đánh giá sự có mặt, ước lượng số lượng bản sao và đánh giá biểu hiện của cấu trúc rd29A::ZmDREB2.7tv ở mức độ phiên mã. Cây chuyển gen thế hệ T2 thuộc dòng D5.8 mang gen ZmDREB2.7tv cho thấy tăng cường sự biểu hiện của gen này trong thí nghiệm xử lý hạn nhân tạo.
KIẾN NGHỊ
1. Thực hiện các thí nghiệm để kiểm tra ảnh hưởng của gen ZmDREB2.7tv
lên các gen khác liên quan đến con đường chống chịu hạn của cây.
2. Thực hiện các thí nghiệm đánh giá về sinh lý, sinh hóa của cây chuyển gen.
3. Thực hiện các thí nghiệm đánh giá tính trạng chịu hạn của cây chuyển gen trong nhà lưới ở các giai đoạn khác nhau.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2017), Báo cáo kết quả thực hiện kế hoạch tháng 12 năm 2017 Ngành Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.
https://www.mard.gov.vn/ThongKe/Lists/BaoCaoThongKe/Attachments/132 /Baocao_T12_2017.pdf .
2. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Hữu Kiên (2013), ‖Thiết kế vector biểu hiện gen chịu hạn NTCB-ZmNF-YB2 ở ngô‖. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nôngthôn, 7, tr. 31-37.
3. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Nguyễn Hữu Kiên, Dương Tuấn Bảo (2013), ‖Nghiên cứu biến nạp gen liên quan đến khả năng kháng hạn và thuốc trừ cỏ vào giống đậu tương ĐT22‖. Tạp chí Khoa học và công nghệ, 11, tr.3-9.
4. Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Lê Thị Mai Hương, Phạm Thị Hương, Lê Thị Lan, Nguyễn Chiến Hữu, Nguyễn Hữu Kiên, Trần Duy Hưng, Lê Huy Hàm (2015), ‖Nghiên cứu chuyển gen chịu hạn NF-YB2 vào một số dòng ngô Việt Nam‖. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 7, e.3530
5. Huỳnh Thị Thu Huệ, Nguyễn Văn Trường, Bùi Mạnh Minh, Đoàn Thị Bích THảo, Nguyễn Xuân Thắng, Nông Văn Hải, Bùi Mạnh Cường (2014), ‖Thiết kế vector biểu hiện mang gen modiCspB và chuyển gen này vào cây ngô‖.
Tạp chí công nghệ sinh học, 12(1), tr. 125 – 132.
Tài liệu Tiếng Anh
6. Ashraf, M., & Akram, N. A. (2009), ―Improving salinity tolerance of plants through conventional breeding and genetic engineering: an analytical comparison‖. Biotechnology advances, 27(6), pp. 744-752.
7. Brookes, G., Barfoot, P. (2017), ―Farm income and production impacts of using GM crop technology 1996–2015‖. GM crops & food, 8(3), pp. 156-193. 8. Chapman, S. C., Edmeades, G. O. (1999), ―Selection improves drought
tolerance in tropical maize populations: II. Direct and correlated responses among secondary traits‖. Crop Science, 39(5), pp. 1315-1324.
9. Chaves, M. M., Maroco, J. P., & Pereira, J. S. (2003), ―Understanding plant responses to drought—from genes to the whole plant‖. Functional plant biology, 30(3), pp. 239-264.
10. Chen, J. Q., Meng, X. P., Zhang, Y., Xia, M., & Wang, X. P. (2008), ―Over- expression of OsDREB genes lead to enhanced drought tolerance in rice‖.
Biotechnology letters, 30(12), pp. 2191-2198.
11. Chen, J., Xia, X., & Yin, W. (2009). ―Expression profiling and functional characterization of a DREB2-type gene from Populus euphratica”.
Biochemical and Biophysical Research Communications, 378(3), pp.483- 487.
12. Claassen, M. M., & Shaw, R. H. (1970), ―Water deficit effects on corn. I. Grain components‖. Agronomy journal, 62(5), pp. 652-655.
13. Edmeades, G.O., Bolaños, J. J., Elings, A., Ribaut, J-M., Bänziger, M., Westgate., M. E. (2000), The role and regulation of the anthesis-silking interval in maize. pp. 43-73. In: M.E. Westgate and K.J. Boote (eds.). Physiology and modeling kernel set in maize. CSSA Special Publication No. 29. CSSA, Madison, WI
14. Frame, B., Warnberg, K., Main, M., Wang., K. (2015), Maize (Zea mays L.). In Wang K, eds. Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology, vol 1223. Springer, New York, NY.
15. Fromm, M. E., Morrish, F., Armstrong, C., Williams, R., Thomas, J., Klein, T. M. (1990), ―Inheritance and expression of chimeric genes in the progeny of transgenic maize plants‖. Nature Biotechnology, 8(9), pp.833-839.
16. Haake, V., Cook, D., Riechmann, J., Pineda, O., Thomashow, M. F., & Zhang, J. Z. (2002), ―Transcription factor CBF4 is a regulator of drought adaptation in Arabidopsis‖. Plant physiology, 130(2), pp. 639-648.
17. Hu, H., Xiong, L. (2014), ―Genetic engineering and breeding of drought- resistant crops‖. Annual review of plant biology, 65, pp. 715-741.
18. ISAAA. 2016. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2016.
ISAAA Brief No. 52. ISAAA: Ithaca, NY.
19. ISAAA. 2017. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops in 2017: Biotech Crop Adoption Surges as Economic Benefits Accumulate in 22 Years. ISAAA Brief No. 53. ISAAA: Ithaca, NY.
20. Kasuga, M., Miura, S., Shinozaki, K., & Yamaguchi-Shinozaki, K. (2004), ―A combination of the Arabidopsis DREB1A gene and stress-inducible rd29A
promoter improved drought-and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer‖. Plant and Cell Physiology, 45(3), pp.346-350.
21. Liu, Q., Kasuga, M., Sakuma, Y., Abe, H., Miura, S., Yamaguchi-Shinozaki, K., & Shinozaki, K. (1998), ―Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought-and low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis‖. The Plant Cell, 10(8), pp. 1391- 1406.
22. Liu, S., Wang, X., Wang, H., Xin, H., Yang, X., Yan, J., ... & Qin, F. (2013), ―Genome-wide analysis of ZmDREB genes and their association with natural variation in drought tolerance at seedling stage of Zea mays L‖. PLoS genetics, 9(9), e1003790.
23. Novillo, F., Alonso, J. M., Ecker, J. R., & Salinas, J. (2004), ―CBF2/DREB1C is a negative regulator of CBF1/DREB1B and CBF3/DREB1A expression and plays a central role in stress tolerance in Arabidopsis”. Proceedings of the National Academy of Sciences, 101(11), pp. 3985-3990.
24. Ohme-Takagi, M., Shinshi, H. (1995), ―Ethylene-inducible DNA binding proteins that interact with an ethylene-responsive element‖. Plant Cell, 7, pp. 173–182.
25. Rogers, S. O., & Bendich, A. J. (1989), ―Extraction of DNA from plant tissues‖. In Plant molecular biology manual, pp. 73-83. Springer, Dordrecht. 26. Sakuma, Y., Maruyama, K., Osakabe, Y., Qin, F., Seki, M., Shinozaki, K., &
Yamaguchi-Shinozaki, K. (2006), ―Functional analysis of an Arabidopsis
transcription factor, DREB2A, involved in drought-responsive gene expression‖. The Plant Cell, 18(5), pp. 1292-1309.
27. Sambrook, J., Fritsch, E. F., & Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual (No. Ed. 2). Cold spring harbor laboratory press.
28. Wang, H., & Qin, F. (2017), ―Genome-wide association study reveals natural variations contributing to drought resistance in crops‖. Frontiers in plant science, 8, pp. 1110.
PCR assay withHMG I/Y as an endogenous reference gene‖. Plant Molecular Biology Reporter, 22(3), pp.289-300.
30. Yoshida, T., Mogami, J., & Yamaguchi-Shinozaki, K. (2014), ―ABA-dependent and ABA-independent signaling in response to osmotic stress in plants‖.
Current opinion in plant biology, 21, pp. 133-139.
Trang web
31. FAO, http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC, cập nhật ngày 28/05/2018. 32. USDA, https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/biotechnology/permits-
notifications-petitions/sapermits/ctstatus, cập nhật ngày 19/11/2018.
33. USDA (2018) ―World Agricultural Production, Circular Series WAP 11-18‖ Released 08/11/2018. https://usda.library.cornell.edu/concern/publications/- 5q47rn72z?locale=en